Normele din 10 iunie 2004

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile

și grăsimile brute, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Articolul 3

— Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 15.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 15/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor

privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute

ANEXĂ

la norma veterinară

3.3.

Fiole uscate din metal necorosiv sau din sticlă cu capace ce asigură o închidere etanșă; suprafață de lucru ce permite ca proba test să fie difuzată la vreo 0,3g/cm 2

.

3.4.

Etuva termoreglabila

(±1°C),

cu ventilatie și care asigură reglarea rapidă a temperaturii

C

).

3.5.

Etuva cu vacuum încălzita electric dotata cu o pompă de ulei sau un mecanism pentru introducerea de aer uscat fierbinte sau a unui agent de uscare (de ex. oxid de calciu).

3.6.

Desicator

cu

placă

confecționată

dintr-un

metal perforat gol sau

din porțelan ce conține un agent de uscare eficient.

4.

Procedură

N.B.: Operațiunile descrise de această secțiune trebuie să fie efectuate imediat după deschiderea pachetelor de probe. Analiza trebuie să fie efectuată în cel puțin un duplicat.

4.1.

Preparare

4.1.1.

Furaje, altele decât cele ce sunt sub incidența punctelor 4.1.2. și 4.1.3. Se iau cel puțin 50 de grame din probă. Dacă este necesar, se macină și se împarte în așa fel, încât să de evite orice variație în conținutul de umiditate(vezi 6).

4.1.2.

Cereale și ovăz

Se iau cel puțin 50 de grame din probă. Se macină în particule din care cel puțin 50°/c,

trec printr-o sită cu plasă de

O, 75mm și nu se permite să fie retinute mai mult de 10% particule pe un ochi de plasă de 1mm

2

.

4.1.3.

Furaje sub formă lichidă sau de pastă, furaje

compuse predominant din uleiuri și grăsimi.

Se iau circa

25 de g din probă, se cântăresc cu o aproximație de 1 O

mg, se adaugă o cantitate corespunzătoare de nisip anhidros, cântărit cu o aproximație de 1 O

mg și se amestecă până este obținut un produs omogen.

(1)

Pentru uscarea cerealelor, a făinii, a ovăzului și a crupelor de ovăz, etuva trebuie să aibă o astfel de capacitate termică, încât atunci când este pre-fixat la 131°C acesta să revină la acea temperatură în mai puțin de 45 de minute după numărul maxim de probe test ce au fost plasate simultan în interior să se usuce. Ventilatia trebuie să fie astfel ca, atunci când sunt mai multe probe de grâu obișnuit decât le poate conține și sunt uscate timp de două ore, rezultatele diferă de cele obținute după patru ore de uscare cu mai puțin de 0,715%.

4.2.

Uscare

4.2.1.

Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de

4.2.2.

și 4.2.3.

Se cântărește o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia cu o aproximație de 0,5 mg. Se cântăresc în fiola cântărita cu o aproximație de 1 mg, aproximativ 5 g din probă și chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acestuia, în etuva preîncălzita la 103°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura

etuvei revine la 103°C. Se înlocuiește capacul de pe fiola, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator(3.6) și se cântărește cu o aproximație de 1 mg.

Pentru furaje combinate compuse predominant din uleiuri și grăsimi, se usucă în etuva timp de încă 30 de minute la 130°C. Diferența dintre două cântăriri nu trebuie să depășească 0,1% umiditate.

4.2.2. Cereale, făină, ovăz și făină

Se cântărește o fiola (3.3) împreună cu capacul acesteia, cu o aproximație de 0,75mg. Se cântărește în fiola cântărita cu o aproximație de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată și chiar se difuzează. Se plasează fiola, fără capacul acesteia, în etuva preîncălzita la 130°C. Se introduce containerul cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore calculate din momentul în care temperatura cuptorului revine la 103°C. Se înlocuiește capacul de pe container, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă se răcească timp de 30- 45 de minute în desicator(3.6) și se cântărește cu o marjă de 1mg.

4.2.3. Furaje combinate ce conțin mai mult de 4% sucroză sau lactoză: furaje simple precum păstăi de fasole, produse cereale hidrolizate, semințe de malț, cartofi și sfeclă uscată, pește și zahăr solubil; furaje combinate ce conțin mai mult de 25% săruri minerale, incluzând apă de cristalizare.

Se cântărește o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia, cu o aproximație

de 0,75mg. Se cântăresc în containerul cântărit cu o marjă de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată și chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acesteia, în etuva cu vacuum preîncălzit între 80-85°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura etuvei să scadă nejustificat.

Se aduce presiunea până la 100 Torr și se lasă să se usuce timp de patru ore la această temperatură, fie într-un curent de aer fierbinte, uscat fie utilizându-se un agent de uscare (aproximativ

300 g pentru 20 de probe).

În ultimă instanță, se deconectează pompa de vacuum, atunci când a fost atinsă presiunea prescrisă.

Timpul

de

uscare

se

calculează

din

momentul

când temperatura cuptorului revine la 80-85°C. Se aduce etuva cu grijă înapoi la presiunea atmosferică. Se deschide etuva, se plasează imediat capacul pe fiola, se îndepărtează fiola din etuva, se lasă să se răcească timp de 30-45 în desicator(3.6) și se cântărește cu o aproximație de 1 mg. Se usucă timp de încă 30 de minute în etuva cu vacuum la 80-85°C și se recântărește. Diferența dintre două cântăriri nu trebuie să depășească 0,71 °/o

umiditate.

4.3.

Uscare preliminară

4.3.1.

Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de 4.3.2.

Furaje solide cu un conținut ridicat de umiditate ce face ca măcinarea să fie supusă uscării preliminare după cum urmează: Se cântăresc 50g de probă nemăcinată cu o aproximație de 10mg (furajele comprimate și aglomerate pot fi împărțite după duritate , dacă este necesar) într-un container potrivit (de ex. o placă de aluminiu de 20x12 cm cu o ramă de 0,75cm). Se lasă să se usuce într-o etuva de la 60-70°C până când conținutul de umiditate s-a redus la 8-12%. Se îndepărtează din etuva, se lasă descoperit ca să se răcească în laborator pentru o oră și se cântărește cu o aproximație de 1O mg. Se zdrobește imediat, așa cum s-a indicat la punctul 4.1.1. și se usucă așa cum s-a indicat la punctul 4.2.1. sau 4.2.3., în conformitate cu natura furajului.

,

4.3.2.

Cereale

Boabele cu un conținut de umiditate · de peste 17%, trebuie să fie supuse unei uscări preliminarii după cum urmează:

Se cântăresc 50g de boabe neîncolțite, cu o aproximație de 10mg într-un container corespunzător (de ex. o placă de aluminiu de 20x12 cm cu o ramă de 0,5cm). Se lasă să se usuce timp de 5-7 minute într-o etuva, la 130°C. Se scoate din etuva, se lasă să se răcească descoperit în laborator, timp de două ore și se cântăresc cu o aproximație de 1 O

mg. Se macină așa cum s-a indicat la 4.1.2. și se usucă, așa cum s-a indicat la punctul 4.2.2.

5.

Calcularea rezultatelor

Conținutul de umiditate, ca procent din probă, este calculat utilizând următoarea formulă:

5.1.

Uscare fără uscare preliminară (E-m)x

ioo

E

unde:

E=masă inițială a probei test, în grame, m=masa probei test uscate, în grame,

5.2.

Uscare cu uscare preliminară

[(M'-m)M

+

E-M]xlOO=

100 ( 1 -

Mm)

M'

E

EM'

unde:

E=masă inițială a probei test, în grame,

M= masa a probei test după uscare preliminară, în

grame,

M'= masa probei test după zdrobire, în grame, m=masa probei test uscate, în grame.

5.3. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,2°/c, de umiditate.

6.

Observatie

Dacă măcin '

area se dovedește a fi necesară și dacă

l

aceasta este estimată că alterează continutul în umiditate al produsului, rezultatele analizei componenților furajului trebuie să fie corectate pe baza conținutului probei în starea inițială a acesteia.

li. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE

A.

MICRODIFUZIE

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine conținutul de baze azotate în furaje, exprimate ca amoniac.

2.

Principiu

Proba este extrasă cu apă și soluție clarificată și filtrată. Bazele

azotate

volatile

sunt

dislocate

prin

micro-difuzie, utilizându-se o soluție de carbonat de potasiu, colectată într-o soluție de acid boric și titrată cu acid sulfuric.

3.

Reactivi

3.1.

20% (w/v) soluție de tricloracetic.

3.2.

Indicator: se dizolvă 33 de mg de verde bromcrezol și 65 de mg de roșu metil în 100ml de etanol 95-96%(v/v).

'

3.3.

Solutie de acid boric:

'

Într-un cilindru gradat de 1litru se dizolvă 1O g de acid boric A.R. în 200ml de etanol 95-96%(v/v) și 700ml de apă. Se adaugă

1O ml de indicator(3.2.). Se amestecă

și dacă e necesar, se ajustează

culoarea soluției spre roșu deschis, adăugând o soluție de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluție va fixa un maxim de 300 Dg de NH 3

.

3.4.

Soluție saturată de carbonat de potasiu:

Se dizolvă 1OOg de carbonat de potasiu A.R. în 100 ml de apă fiartă. Se lasă să se răcească, se filtrează.

3.5.

Acid sulfuric 0,02 N.

4.

Aparatură

4.1.

Mixer (tip pahar): aproximativ 35-40 r.p.m.

4.2.

Celule

Conway

de

plastic

sau

de

sticlă

(vezi diagrama).

4.3.

Microbiurete gradate în 1/100ml.

5.

Procedură

Se cântăresc 1Og de probă,

cu o aproximație de 1mg și se plasează cu 100ml de apă într-un pahar gradat de 200 ml. Se amestecă în pahar timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluție de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu vigoare și se filtrează printr-un filtru plisat.

Utilizând o pipetă, se introduce 1 ml de soluție de acid boric(3.3) în partea centrală a celulei Conway și 1 ml din filtratul probei în coroana celulei. Se acoperă parțial cu un capac lubrifiat. Se lasă să cadă rapid 1 ml de soluție de carbonat de potasiu saturat (3.4) în coroană și se închide capacul, astfel încât celula să nu primească aer. Se întoarce celula cu grijă, rotind-o

în plan orizontal, astfel încât cei doi reactivi să fie amestecati.

Se la '

să incubat fie cel puțin patru ore la temperatura

camerei fie pentru o oră la 40°C.

Utilizând o microbiuretă(4.3), se titrează bazele volatile în soluție de acid boric cu acid sulfuric 0,02N(3.5).

Se efectuează un test steril, utilizând aceeași procedură, dar fără ca proba să fie analizată.

6.

Calcularea rezultatelor

1ml de H2SO4 0,02N corespunde la 0,34 mg de amoniac. Se exprimă rezultatul ca procentaj al probei.

Repetabilitate

Diferența între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:

-

10% în valoare relativă, pentru conținut de amoniac mai puțin de 1,0%;

-

O,1%

în

valoare

absolută,

pentru

conținut

de amoniac de 1,0% sau mai mult.

7.

Observatie

Se diluează '

filtratul initial, dacă continutul de amoniac al

probei depășește 0,76%.

'

'

B.

PRIN DISTILARE

1.

Scopul și domeniul de aplicare

Această metodă face posibilă determinarea conținutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, în faina de pește ce nu conține practic uree. Aceasta este aplicabilă numai pentru un conținut de mai puțin de 0,25%.

2.

Principiu

Proba este extrasă cu apă și soluție de clarificare. Bazele azotate

volatile

sunt

dislocate

la

punctul

de

fierbere, adăugându-se oxid de magneziu și colectate într-o cantitate

specifică de acid sulfuric, al cărui exces este titrat apoi cu o solutie de hidroxid de sodiu.

'

3. Reactivi

3.1.

20% (w/v) soluție de acid tricloracetic.

3.2.

Oxid de magneziu

3.3.

Emulsie anti-spumă (de ex. silicon).

3.4 Acid sulfuric O,1N.

l

3.5.

Solutie de hidroxid de sodiu O,1 N.

3.6.

0,3%, (m/v) soluție de metil roșu în etanol 95-96%(v/v).

4.

Aparatură

4.1.

Mixer (tip pahar): aproximativ 35-40 r.p.m.

4.2.

Aparat de distilare de tip Kjeldahl.

5.

Procedură

Se cântăresc 10g de probă cu o aproximație de 1mg și se plasează cu 100ml de apă într-un balon cotat de 200ml. Se omogenizeaza timp de 30 de minute. Se adaugă 50ml de soluție de acid tricloracetic(3.1), se completează volumul cu apă, se agită energic și se filtrează printr-un filtru cutat.

Se ia o cantitate de filtrat clar corespunzător

pentru

A

I

conținutul estimat de baze azotate volatile(100ml sunt de obicei potrivite). Se diluează până la 200ml și se adaugă 2g de oxid de

magneziu

(3.2.)

și

câteva

picături

de

emulsie

anti­ spumă(3.3). Soluția trebuie să fie alcalină față de hârtia de turnesol, altfel se adaugă puțin oxid de magneziu (3.2.). Se distila aproximativ 150 ml de soluție în aparatul Kjeldahl și se colectează distilatul într-un pahar Erlenmeyer ce conține un volum

măsurat

cu

acuratete

(25-50ml)

de

acid

sulfuric O,1 N(3.4). ln timp ce se distila, se evită supraîncălzirea pe părțile laterale. Se fierbe soluția de acid sulfuric timp de 2 minute, se răcește și se titrează apoi excesul de acid sulfuric cu soluție de hidroxid de sodiu O,1N(3,5) în prezența indicatorului de roșu metil (3.6).

Se

efectuează

o

proba

martor

utilizand

aceeași procedură.

6.

Calcularea rezultatelor -

1ml de H2SO4 O,1N corespunde la 1,7 mg de amoniac. Se exprimă rezultatul ca procent din probă.

Repetabilitate

Diferența între rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeași probă, nu trebuie să depășească, în valoare relativă, 10°/o amoniac.

III.

DETERMINAREA FOSFORULUI TOTAL METODA FOTOMETRICĂ

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibilă determinarea conținutului de fosfor total din furaje. Este corespunzătoare, în mod particular, pentru analiza produselor cu nivel scăzut de fosfor. În unele cazuri poate fi utilizată o metodă gravimetrică, (produs bogat în fosfor).

2.

Principiu

Proba este mineralizată, fie prin combustie uscată(în cazul furajelor organice) sau prin digestie acidă (în cazul compușilor minerali și a furajelor lichide) și plasată într-o soluție de acid.

Soluția este tratată cu reagent molibdovanadiu. Densitatea optică a soluției galbene astfel formate este măsurată într-un spectrometru la o lungime de undă de 430nm.

3.

Reactivi

3.1.

Carbonat de calciu p.a

3.2.

Acid clorhidric p.a d:1,1 (aproximativ 6N).

3.3.

Acid azotic p.a, d: 1,045.

3.4.

Acid azotic p.a., d: 1,38-1,42.

3.5.

Acid sulfuric p.a., d: 1,84.

3.6.

Reactiv molibdovanadat:

Se

amestecă

200ml

de soluție

de heptamolibdat

de amoniu(3.6.1. ),

200ml

de

soluție

de

monovanadat

de amoniu(3.6.2) și 134ml de acid azotic, într-un balon cotat de un litru. Se completează volumul cu apă distilata.

3.6.1.

Soluție de heptamolibdat de amoniu:

Se

dizolvă

în

apă

distilata

fierbinte

100g

de heptamolibdat de amoniu p.a. (NH4)6Mo7O24_ 4H2O. Se adaugă 10ml de amoniac(d:0,91) și se completează cu apă distilata până la un litru.

3.6.2.

Solutie de monovanadat de amoniu:

'

2,735g

de monovanadat

de amoniu

p.a. NH4VO3

se dizolvă în 400ml de apă distilata fierbinte · . Agitând constant, se adaugă lent 20ml de acid azotic p.a diluat (7ml de HNO 3 (3.4)

+

13ml de H 2 O) și se completează cu apă distilata până la un litru.

3.7.

Soluție standard de 1mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387g de fosfat dihidrogenat de potasiu p.a. KH2PO4 în apă. Se completează cu apă până la un litru.

4.

Aparatură

4.1.

Creuzete pentru cenușă din porțelan sau siliciu.

4.2.

Cuptor electric cu termostat stabilit la 550°C.

4.3.

Balon Kjeldahl de 250ml.

4.4.

Baloane gradate și pipete de precizie.

4.5.

Spectrofotometru.

4.6.

Eprubete gradate:25-30ml.

5.

Procedură

-

5.1.

Prepararea solutiei

ln conformitate cu na ' tura probei se prepară o soluție așa cum a indicat punctul 5.1.1 sau 5.1.2.

5.1.1.

Procedura uzuală

Se cântărește 1g sau mai mult din probă cu o aproximație de 1mg. Se plasează proba test într-un balon Kjeldahl, se adaugă 20ml de acid sulfuric (3.5), se agită pentru a impregna substanța complet cu acid și pentru a se preveni ca aceasta să nu

se

lipească

de

pereții

balonului,

se

încălzește

și

se păstrează la punctul de fierbere timp de 1O minute. Se lasă să se răcească puțin, se adaugă

puțin acid azotic (3.4) și se aduce apoi la punctul de fierbere. Se repetă această procedură până când este obținută o soluție incoloră. Se răcește, se adaugă puțină apă, se decantează lichidul într-un balon cotat de 500 de ml, clătind cu apă fierbinte balonul Kjeldahl. Se lasă să

se

răcească,

se

completează

volumul

cu

apă,

se omogenizează și se filtrează.

5.1.2.

Probe ce conțin substanțe organice și libere de calciu și fosfați de magneziu

Se cântăresc aproximativ 2,5 g din probă, cu o aproximație de 1mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă proba test până când se omogenizeaza complet cu 1g de carbonat de

calciu(3.1). Se calcinează în cuptor la

550°C+5°C

până când este obținută o cenușă albă sau gri (nu contează puțin mangal). Se transferă cenușa într-o capsula de portelan de 250ml. Se adaugă 20ml de apă și acid clorhidric(3.2) până încetează efervescența .

Se adaugă încă 10ml de acid clorhidric (3.2). Se plasează capsula de portelan pe o baie de nisip și se evaporă până se usucă pentru a face silicatul insolubil. Se redizolvă reziduul în 10ml de acid azotic(3.3) și se fierbe pe baia de nisip timp de

5 minute, fără să se evaporeze, până se usucă. Se decantează

lichidul

într-un

balon

cotat

de

500ml,

clătind capsula de portelan de câteva ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se omogenizează și se filtrează.

5.2.

Dezvoltarea colorației și măsurarea densității optice Se diluează o parte a picăturii filtrate obținută la 5.1.1. sau

5.1.2., pentru a obține o concentrație în fosfor de cel mult 40µg/ml.

Se

plasează

10ml

din

această

soluție

într-o eprubetă(4.6)

și

se

adaugă

10ml

de

reactiv molibdovanadat(3.6). Se omogenizează și se lasă să stea cel puțin 1O minute, la 20°C. Se măsoară densitatea optică într-un spectrometru la lungimea de undă de 430nm fata de o soluție obținuta prin adăugare de 10ml de reactiv molibdovanadat (3.6) în 10ml de apă.

5.3.

Curba de calibrare

Din soluția standard(3.7.) se prepară soluții ce conțin respectiv 5,10,20,30 și 40 µg de fosfor per ml. Se iau 10ml din fiecare

din

aceste

soluții

și se

adaugă

10ml

de reactiv molibdovanadat (3.6). Se omogenizează și se lasă să stea cel puțin 1O minute la 20°c. Se măsoară densitatea optică , așa cum a indicat punctul 5.2.

Se trasează curba de calibrare prin împărțirea densităților optice față de cantitățile corespunzătoare de fosfor. Curba va fi

liniară pentru concentrații între O și 40 µg/ml.

6.

Calcularea rezultatelor

Se determină cantitatea de fosfor din proba test pnn utilizarea curbei de calibrare.

Se exprimă rezultatul ca procent din probă.

Repetabilitate

Diferența între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeași probă nu trebuie să depășească:

3% în valoare relativă, pentru conținut de fosfor de mai puțin de 5%;

O,15% în valoare absolută, pentru conținut de fosfor de 5% sau mai mult.

IV. DETERMINARE DE ULEIURI ȘI GRĂSIMI BRUTE

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această

metodă

este

utilizată

pentru

determinarea uleiurilor și grăsimilor brute din furaje. Aceasta nu se referă la analiza semințelor uleioase și a fructelor oleaginoase definite de legislația comunitară specifică.

Utilizarea celor două proceduri descrise mai jos depinde de natura și compoziția furajului și motivul pentru efectuarea analizei.

1.1.

Procedura

A

-

Uleiuri

și

grăsimi

brute

direct

extractibile

Această metodă este aplicabilă materiilor furajere din plante, cu excepția celor incluse în scopul Procedurii B.

1.2.

Procedura B - Uleiuri și grăsimi brute totale

Această procedură este aplicabilă materiilor furajere de origine animală și tuturor furajelor combinate. Aceasta trebuie să fie utilizată pentru toate materiile din care grăsimile și uleiurile nu pot fi extrase complet fără o hidroliză anterioară (ex. gluten,

drojdie,

proteine

din

cartofi

și

produse

supuse proceselor precum extrudarea, floconarea și încălzirea).

1.3.

Interpretarea rezultatelor

În toate cazurile în care este obtinut un rezultat mai ridicat prin utilizarea Procedurii B, decât pr ' in Procedura A, rezultatul

obținut prin Procedura B va fi acceptat ca valoare adevărată.

2.

Principiu

2.1

Procedura A

Proba este extrasă cu eter etilic. Solventul este distilat, iar reziduul este uscat și cântărit.

2.2

Procedura B

Proba este tratată la cald cu acid clorhidric. Amestecul este răcit și filtrat. Reziduul este spălat, uscat și supus determinării, în conformitate cu Procedura A.

3.

Reactivi

3.1.

Eter etilic, punct de fierbere: 40-60°C. Valoarea de bromin trebuie să fie mai puțin de 1, iar reziduul din evaporare mai puțin de 2mg/100ml.

3.2.

Sulfat de sodiu, anhidru

3.3.

Acid clorhidric, c=3moli HCI/I

3.4.

Cu ajutorul filtrării, Kieselguhr, supercelula Hyflo.

4.

Aparatură

4.1.

Aparatură de extracție. Dacă a fost dotată cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului trebuie să fie astfel încât să producă aproximativ 10cicluri/oră; dacă este utilizat tipul non­ sifon, rata refluxului trebuie să fie de aproximativ 10ml per minut.

4.2.

Canule de extractie, libere de materie solubilă în eter

etilic și care să aibă o po '

rozitate în conformitate cu cerințele punctului 4.1.

4.3.

Etuva de uscare, fie o etuva cu vacuum fixat la

75°C+3°C

fie o etuva cu aer fixat la 1 oo°C+3°C.

5.

Procedură

5.1.

Procedura A(vezi punctul 8.1)

Se cântăresc 5g din probă, cu o aproximație de 1mg, acestea se transferă

într-un cartuș de extracție(4.2) și se acoperă cu un tampon de vată degresat.

Se plasează un cartuș într-un extractor(4.1) și se extrage timp de șase ore cu eter etilic(3.1). Se colectează extractul din eter etilic într-o retortă uscată, cântărită ce conține fragmente de piatră ponce (1).

Se distila solventul. Se usucă reziduul, menținând retorta timp de o oră și jumătate în etuva de uscare(4.3) .

Se lasă să se răcească într-un desicator și se cântărește. Se usucă din nou timp de 30 de minute pentru a se asigura că greutatea uleiurilor și grăsimilor rămâne constantă (pierderea în greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie de mai puțin de 1 mg).

5.2.

Procedura B

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier,

cupru, mangan și zinc*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.355 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode

naționale

de

analiză

pentru

controlul

oficial

al furajelor

cu

referire

la

conținutul

în

zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Articolul 3

— Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 16.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 16/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză

pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc

ANEXĂ

la norma veterinară

suspensia la diluția 1/1O cu soluție de clorură de sodiu (4.3). Transmisia luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, măsurată la o lungime de undă de 650 nm într-un cm de celulă

față de soluția

de clorură

de sodiu (4.3). Această suspensie poate fi menținută pentru o săptămână la cca. 4

QC

4.

Mediu de cultură și reactanți

4.1.

mediu de cultură (b) Carne peptonată

6,0 g

Triptone

4,0

g

Extract de drojdie Extract de carne Glucoză

Agar Apă

3,0 g

1,5 g

1,0 g

10,0 la 20,0 g

1 OOO

ml

ph 6,5 la 6,6 (după sterilizare)

4.2.

Mediu de probă (b) Triptone

10,0 g Extract de drojdie

3,0 g

Extract de carne Glucoză

Agar Tween 80 Apă

1,5 g

1,0

g

10,0 la 20,0 g

1

ml

1 OOO

ml

pH 6,5 (după sterilizare)

4.3.

Soluție de clorură de sodiu 0,8% (w/v): se dizolvă 8 g clorură de sodiu în apă și se diluează până la 1OOO ml; se steriIizează.

4.4.

Amestec de metanol/apă șI acid clorhidric (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v)

4.5.

Tampon fosfat c , pH 6,5:

Fosfat hidrogenat de potasiu K2HPO4

22,15 g Fosfat dihidrogenat de potasiu KH2PO4

27,85 g. Apă până la

1

OOO ml

4.6.

Acid clorhidric (d: 1,18 la 1,19).

4.7 Acid clorhidric (O,1 M).

4.8.

Hidroxid de sodiu solutie 1 M.

'

4.9.

Sulfit de sodiu solutie cca. 0,5 M

'

4.1O. Soluție roșu de bromcrezol 0,04

%

(w/v): se dizolvă

O,1 g de roșu de bromcrezol în 18,5 ml din soluția de hidroxid de sodiu 0,01 M. Se aduce volumul la 250 ml cu apă și se amestecă.

4.11. Substantă standard: zinc-bacitracină de activitate

cunoscută (în u. i.).

'

5.

Solutii standard

'

Se cântărește o cantitate de zinc-bacitracină standard

(4.11) ce corespunde la 1050 u.i (conform activității indicate). Se adaugă 5 ml de acid clorhidric 0,1 M (4.7) și se lasă 15 minute. Se adaugă 30 ml de apă, se ajustează pH-ul la 4,5 cu tampon fosfat (4.5) (cca. 4 ml}, se aduce la un volum de 50 ml cu apă și se amestecă bine (1 ml = 21 u.i.).

Din această soluție se prepară, prin diluție succesivă cu tampon fosfat (4.5), următoarele soluții:

sa O, 42 u.i./ml S4 0,221 u.i./ml s2 O,105 u.i./ml s1 0,0525 u.i./ml

6.

Prepararea soluțiilor de extract și de probă

6.1

Extract , ie

6.1.1

Premixuri și furaje minerale

Se cântărește o cantitate de probă de 2,0 până la 5,0 g, se adaugă 29,0 ml de amestec (4.4) și 1,0 ml de soluție de sulfit de

sodiu (4.9) și se agită ușor. Se verifică dacă pH-ul este cca. 2. Se agită

1O

minute și se centrifughează. Se prelevează o picătură

corespunzătoare din soluția

de supernatant

și se ajustează pH-ul la 6,5 prin intermediul unei soluții de hidroxid 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluție roșu de bromcrezol (4.1 O)

ca indicator. Se diluează cu tampon fosfat (4.5) se obține un conținut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u.i./ml (=u8)

6.1.2.

Concentrate proteice

Se cântărește o cantitate de probă de 10,0 g, se adaugă 49,

O

ml de amestec (4.4) și 1,0 ml de soluție de sulfit de sodiu (4.9) și se agită ușor. Se verifică dacă pH-ul este aproximativ 2. Se agită 1 O

minute. Se adaugă 50 ml de tampon fosfat (4.5), se agită timp de 15 minute și se centrifughează. Se prelevează un volum corespunzător de soluție de supernatant și se ajustează pH-ul la 6,5 prin intermediul soluției de hidroxid de sodiu - 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluție roșu de bromcrezol (4.1 O)

ca indicator. Se evaporă până la aproximativ jumătate de volum într-un evaporator rotund la o temperatură ce nu depășește 35QC.

Se diluează cu tampon fosfat (4.5) până se

obține un conținut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u.i./ml (= u8).

6.1.3.

Alte furaje

Se cântărește o cantitate de probă de 10,0 g (20,0 g pentru un conținut dorit de zinc-bacitracină de 5 mg/kg). Se adaugă un amestec de 24,0 ml de amestec (4.4) și 1,0 ml de soluție de sulfit de sodiu (4.9) și se omogenizează timp de

1O

minute. Se adaugă 25 ml tampon fosfat (4,5), se agită timp de

15 minute și se centrifughează. Se iau 20 ml de soluție de supernatant și se ajustează pH-ul până la 6.5 prin intermediul soluției de hidroxid de sodiu - 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluție roșu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se evaporă până la 4 ml într-un evaporator rotund, la o temperatură ce nu depășește 35 °C. Se diluează reziduul cu tampon fosfat (4.5) până se obține un conținut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u i../ml (= u8).

6.2. Soluții probă

Din soluția u8 se prepară soluții u4 (conținut așteptat: 0,21u i./ml), u2 (conținut așteptat: O,105 u.i./ml) și u1 (conținut așteptat: 0,0525 u.i./ml) prin intermediul diluției succesive (1-1) cu tampon fosfat (4.5).

7.

Procedura de testare

7.1.

Însământarea mediului de testare

'

Se însămânțează mediul de testare (4.2) cu o suspensie bacteriană

(3.2)

la aproximativ

50

°e.

Prin

experimentări preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2) se determină

cantitatea

de

suspensie

bacteriană

necesară

pentru

a determina cele mai mari și mai curate zone de inhibiție cu diferite concentratii de zinc-bacitracină.

'

7.2.

Prepararea plăcilor de însămânțare

Difuziunea pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentrații din soluția standard (s 8 ,s 4 ,s2,Și s1) și patru concentrații din soluția de testare (u 8

,

u 4

,u 2

și u1). Aceste patru concentrații de extract și standard trebuie, în mod necesar, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a se permite să fie făcute cel puțin opt godeuri cu un diametru de 1O la 13 mm și la nu mai puțin de 30

mm de centru în mediul agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o față din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru și 20 mm înăltime.

'

Se toarnă în plăci o cantitate din mediul însămânțat (4.2)

ca la punctul 7.1. , pentru a se obține un strat gros de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru), se lasă să se solidifice, se formează godeuri și se pun în acestea volume de probă măsurate cu exactitate și soluții standard (între O,1O și O,15 ml per goden, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentrație de cel puțin patru ori astfel

încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.

'

'

7.3.

lncubatie

Se incubează plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2

°e

8.

Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiție cu o aproximație de O, 1

mm. Se înregistrează

valorile medii pentru fiecare concentrație

pe

hârtie

grafică

semilogaritmică

ce

indică logaritmul concentrațiilor în relație cu diametrele zonelor de inhibitie.

'

Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluția

standard cât și pentru extract ca în exemplu de mai jos:

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula:

(a) SL

=

7s1 + 4s2 +S4 - 2sa

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:

(a)

SH

=

7sa + 4S4 +s2 - 2s1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2, U4 și ua cu s1, s2, s 4 și s 8

din formula menționată mai sus.

Se înregistrează valorile calculate ale SL și SH pe aceeași hârtie grafică și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluția standard. Se înregistrează în mod similar UL și UH și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În

absenta

oricărei

interferente

liniile

trebuie

să

fie

paralele. Pentr ' u scopuri practice,

' liniile pot fi considerate

paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 și s1 fie u8 și s8 pot fi înlăturate și SL, SH, UL și UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite":

5S 1

+

2S 2

-

S 4

5s

2

+

2s

4

-

s

8

(a') SL

=

sau

-----sau----

6

6

(b)

SH

=

5S

4

+

2S

2

-S 1

sau

5S

8

+

2S

4

-sS2

6

6

și în mod similar pentru UL și UH. Trebuie să fie întrunite aceleași criterii de paralelism. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză). Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul (log a) activității relative

(A)

prin

intermediul

uneia

din

următoarele

formule,

ce

depinzând de faptul dacă au fost utilizate trei sau patru nivele pentru evaluarea paralelismului.

Pentru patru nivele

(c)

log A=

(ul

+u2 +u4 +ug

-s1

-s2 -S4

-s8 )x0,602

u 4

+u

8

+s 4

+s

8

-u 1 -u 2 -s 1 -s 2

Pentru trei nivele

(d)

log A=

(u

1

+u2+u4-s1-s2

-sJx0,401

U4 +s4 -u1 -s1

sau

(d'} log A=

(u2+u4

+u8

-s1-s4

-s8)x0,401

u 8 +s 8 -u 2 -s 2

Activitatea extractului de probă = activitatea standardului relevant x

A

(u8 =

sa

x A)

Dacă activitatea relativă este în afara zonei de variatie de

la

0,5

la

2,0,

atunci

se

repetă

proba

făcând

aju '

stări

corespunzătoare

ale

concentrațiilor

extractului

sau,

dacă

aceasta nu este posibil, ale soluțiilor standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obținut trebuie să fie considerat ca aproximativ și acesta trebuie notat în raportul final (buletinul de analiză).

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

'

Se exprimă rezultatul în miligrame de zinc-bacitracină per

kilogram de furaj.

Pentru patru nivele

Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate

pe

aceeași '

probă

prin

aceeași

analiză

nu

trebuie

să depășească:

2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de zinc-bacitracină până la 1O mg/kg,

20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 la 25 mg/kg,

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 la 50 mg/kg,

10% din valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg

(1)

1 mg grade de zinc-bacitracină în furaj este echivalent cu 42 unități internaționale (u.i.).

(a)

Pot fi utilizate alte metode, cu condiția să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii bacteriene similare.

(b)

Poate fi utilizat orice mediu de cultură comercială de compoziție similară și care dă aceleași rezultate .

2.

Determinarea de flavofosfolipol prin difuziune in mediu de agar

1.

Domeniu și scop

Metoda

este

utilizată

pentru

determinarea flavofosfolipolului din furaje, concentrate și premixuri. Limita inferioară de determinare este 1 mg/kg (1 ppm).

2.

Principiu

Proba este extrasă cu metanol diluat prin încălzire sub reflux.

După

centrifugare,

extractul

este

purificat

(unde

este necesar) prin tratarea cu rășini schimbătoare și prin schimb de ioni și diluat. Activitatea antibiotică a acestuia este determinată prin măsurarea difuziei de flavofosfolipol într-un mediu de agar însămânțat cu Staphyilococcus aureus. Difuzia este indicată prin formarea de zone de inhibiție a creșterii microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporțional cu

logaritmul

concentrației

de

antibiotic

peste

gama

de

concentratii de antibiotic utilizate.

'

3.

Micro-organism: Staphylococcus aureus ATCC 6538 p

3.1.

Mentinerea culturii stoc

'

Se însămânțează mediul de cultură (4.1) în tuburi înclinate

cu Staphylococcus aureus , se incubează timp de 24 de ore la 37

°e,

se depozitează într-un frigider la aproximativ 4

°e

și se reînsământează în fiecare lună în tuburi înclinate.

'

3.2 Prepararea suspensiei bacteriene (pot fi utilizate alte

metode, cu condiția să se fi stabilit că acestea dau suspensii bacteriene similare)

Se pun deoparte două tuburi ce conțin cultura stoc (3.1) și se însămânțează săptămânal. Se incubează timp de 24 de ore la 37

°e

și se depozitează întru-un frigider la aproximativ 4 QC.

Cu 24 de ore înainte de testare, se însămânțează cu această cultură

două până la patru tuburi înclinate ce conțin mediul de cultură (4.1). Se incubează timp de 16 până la 18 ore la 37 °C. Se efectuează o suspensie de cultură în soluție de clorură de sodiu (4.3). Transmisia

luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 40%, măsurată la la lungimea de undă de 578 nm, într-o celulă de 1 cm în comparație cu soluția de clorură de sodiu. (4.3)

4.

Mediu de cultură și reactivi

4.1

Mediu de cultură

(poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial, de compoziție similară și care dă aceleași rezultate, de ex. mediu antibiotic oxoid 1 (cm 327) cu un adaos de agar oxoid n 3 (L 13)).

Carne peptonată

6,0 g

Triptone

4,0 g

Extract de drojdie

3,0 g

Extract de carne

1,5 g

Glucoză

1,0 g

Agar

15.0 g

Apă

1 OOO ml

ph 6,5 (după sterilizare)

4.2

Mediu de probă

4.2.1.

Strat de bază (poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial, de compoziție similară și care dă aceleași rezultate, de ex. mediu antibiotic oxoid 2 (cm 335) cu un adaos de agar oxoid n 3 (L 13)).

Carne peptonată

6,0 g Extract de drojdie

3,0 g Extract de carne

1,5 g Agar

10.0 g

Apă

1 OOO ml

ph 6,5 (după sterilizare)

I

4.2.2.

Strat de însământare

Ca pentru punctul 4.1, cu adăugarea a 2.0 g de emulsie siliconată anti-spumantă (de ex. SE 2 din Wacker Chemie Gmnh, Munchen).

4.3. Soluție de clorură de sodiu 0.4% (w/v): se dizolvă 4 g de clorură de sodiu a. p. în apă și se diluează până la 1OOO ml apă sterilă.

4.4

Metanol pur

4.5

Metanol 50 % (v/v): se diluează 500 ml de metanol (4.4) cu 500 ml de apă.

4.6.

Metanol 80% (v/v): se diluează 800 ml de metanol (4.4) cu 200 ml de apă.

4.7.

Tris (hidroximetil) aminometan a.p.

4.8.

Soluție metanolică de clorură de potasiu 1.5 % (w / v): se dizolvă 1.5 g de clorură de potasiu a.p. în 20 ml de apă, se aduce volumul la 100 ml cu metanol (4.4)

4.9.

Schimbător de cationi: sub formă de Dowex 50W x 8, 20 la 50 mesh, sodiu (cat. Serva Nr 41 600) sau echivalent.

4.1O Schimbător de anioni: sub formă de Dowex 1 la 2, 50 la 100 mesh, ci (cat. Serva n 4101O) sau echivalent. Înainte de utilizare, se ține timp de 12 la 14 ore în metanol 80% (4.6.)

4.11

Vată de sticlă

4.12

Hârtie indicatoare de Ph (ph 6.6 până la 8.1).

4.13.

Acid ascorbic

4.14.

Substanță standard: flavofosfolipol de activitate cunoscută

5.

Aparatură

5.1 Tub de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 9 mm, lungime: 150 la 200 mm, dotat cu un dop la partea îngustă a capătului inferior și o legătură de sticlă-cauciuc (porțelan) pentru a se conecta cu pâlnia de scurgere (5.2). la capătul superior

5.2 Pâlnie de scurgere de 250ml, dotată cu un dop și cu o legătură sticlă - cauciuc (sau porțelan)

5.3.

balon conic de 250 ml cu legătură sticlă - cauciuc (sau porțelan)

5.4.

Condensator de reflux cu legătură sticlă - cauciuc (sau porțelan)

6.

Solutii standard

'

Se dizolvă o cantitate

cântărită corect din substanta standard (4.14) în metanol 50°/c, (4.5) și se diluează pentru a s ' e

obține o soluție stoc ce conține 100 ug flavofosfolipol per

mililitru. Se depozitează în baloane cu bușon la 4 QC unde această soluție este stabilă pentru mai mult de două luni.

Din această soluție stoc se prepară, prin diluție succesivă cu metanol 50% (4.5), următoarele soluții:

Sa

0.2 ug/ml

S4

0.1 ug/ml

S2

0.05 ug/ml

S1

0.025 ug/ml

7.

Prepararea extractului

7.1.

Extractie

'

7.1.1.

Concentrate, premixuri și furaje minerale

Se cântărește

o cantitate de probă de 2.O la 5.O g și se adaugă

aproximativ

150

mg

de

acid

ascorbic

(4.13).

Se omogenizează cu 150 ml de metanol 50% (4.5) într-un balon conic

(5.3)

și se ajustează

ph-ul

la 8.1

până

la 8.2, cu aproximativ 400 mg de tris (hidroximetil) aminometan (4.7). Se verifică ph-ul cu hârtie indicatoare (4.12). Se lasă să stea 15 minute, apoi se reajustează

ph-ul de la 8.1 la 8.2 cu tris (hidroximetil) aminometan (4.7) și se fierbe timp de 1O minute sub reflux

(5.4) cu amestecare

constantă.

Se lasă să se răcească,

se

centrifughează

amestecul

și

se

decantează extractul.

7.1.2.

Alte furaje

7.2.

Purificarea

(acest

pas

poate

fi

omis

pentru concentrate, premixuri și furaje minerale)

Se amestecă 11O ml de extract cu 11 g de schimbător de cation (4.9), se fierbe timp de un minut sub reflux (5.4) cu amestecare constantă. Se separă schimbătorul de cation prin centrifugare sau filtrare. Se amestecă 100 ml de extract cu 150 ml de metanol

(4.4)

și se depozitează soluția timp de 12 până la 15 ore la 4 °C. Se filtrează și se îndepărtează masa de flacoane în timpul răcirii.

Se inserează un dop de vată de sticlă (4.11) la capătul unui tub de sticlă (5.1), se toarnă în tub 5ml de schimbător de anioni (4.1O) și se spală coloana cu 100 ml de metanol 80 % (4.6). Utilizând pâlnia (5.2), se transferă în coloană un volum filtrat de cel puțin 100 ml ce este de așteptat să conțină 16 ug de flavofosfolipol (200 ml pentru o probă de 30 g de furaj la 1 ppm). Atunci când se consideră necesar, înainte de utilizarea coloanei, se diluează filtratul cu metanol 80

%

(4.6) pentru a se obține un conținut dorit de flavofosfolipol de 16 ug/100ml. Se ajustează rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se înlătură filtratul. Apoi se spală coloana cu 50 ml de metanol 80

%

(4.6) și se înlătură filtratul. Se elutează flavofospfolipolul cu soluție metanolică de clorură de potasiu (4.8) menținând rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se colectează 50 ml de

eluat într-un balon gradat, se adaugă 30 ml de apă și se amestecă. Această solutie ar trebui să aibă un continut de

flavofosfolipol de O; 2ug / ' ml (= u8).

'

7.3.

Solutii de testare

'

Atunci când ce consideră necesar (de ex. când etapa de purificare a fost omisă), se diluează extractul obținut ca la punctul 7.1. cu metanol 50

%

(4.5) pentru a

se obține un conținut dorit de flavofosfolipol de 0.2 ug/ml (=Ua).

Din soluția U 8

se prepară soluții U4 (conținut așteptat: 0.1 ug

I

ml), U 2

(conținut așteptat: 0.05 ug / ml) și U1 (conținut așteptat: 0.025 ug / ml) prin intermediul

diluției succesive (1/1) cu metanol 50% (4.5).

8.

Procedura de efectuare a testării

8.1.

Însăn,ânțarea mediului de probă

Se însămânțE ază rnediul de testare (4.2.2) cu suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ fiO °C. Prin testări preliminare pe plăci

cu

mediu de testare (4.2.2.)

se

determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a indica cele mai mari și

mai curate zone de inhibitie obtinute cu diferite concentratii de

flavofosfolipol (aproximativ '

30 m ' l/ litru).

'

8.2

Pregătirea placilor

Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentrații

din s.oluția

standard (S 8

,

84, S2, S1) și patru concentrații din so l uția de testare (U 8

,

IU4, U2, U1). Aceste patru concentrații

de

extract

șl

cele

standard

trebuie,

în

mod obligatoriu, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg pliîci destul de mari pentru a permite să se efectueze cel puțin opt godeuri în rnediu de agar cu un diametru de 1O până la 13 mrn și n u

n1ai puțin de 30 mn, de centru. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o fațadă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în dian1etru și 20 mm înălț:ime.

Se toarnă în plăci o cantitate din rnediu (4.2.1) pentru a se obține un strat gros ele aproximativ 1,5 mm (45 ml pentru o placă de 200 rnrn diametru) .

Se lasă să se solidifice și apoi peste st.rat cu o cantitate i

din mediu (4.

- 2) ,se însămânțează ca la punc t ul 8. 1 , pentru a se obține un s t rat gros de 1 mm (30 ml pentru o placă d• 3! 2'.00 mrn d i a nn etru). Se lasă să se solidifice din nou 1

se efectuează godeuri și se pun în acestea volume de probă, măsurate cu exactitate și soluții standard (între

O,1 O

și O,15 ml per gaură )

conform diametrului).

Se utilizează fiecare concentrație de cel puțin patru ori, astfel încât fiecare

d etermina r e să fie supusă unei evaluări

a 32

zone

ele inhibiti

r

1.

'

8.3. Incubare

Se incubează plăcile timp de 16 p ină la 18 ore, la 28 până la 30 QCă

9.

Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiție cu o aproximație de 0-1 mm. Se înregistrează

valorile •medii pentru fiecare concentrație

pe

hârtie

grafică

semi-logaritmică

ce

indică logaritmul concentrațiilor în relație cu diametrele zonelor de

inhibitie.

'

Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluția

standard cât și pentru extract , ca în exemplu de mai jos:

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula:

(a)

SL=

1s

1

+4s2+s4-2s

3

10

(b)

SH =

7S8 +4S4

+S2

-2S1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2,

U4

și ua cu s1, s2,

S4

și s 8

din formula menționată mai sus.

Se înregistrează valorile calculate ale SL și SH pe aceeași hârtie grafică și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluția standard. Se înregistrează în mod similar UL și UH și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În

absenta

oricărei

interferente,

liniile

trebuie

să

fie

paralele. Pentr ' u scopuri practice,

' liniile pot fi considerate

paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 și s1 fie u8 și s8 pot fi înlăturate și SL, SH, UL și UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite":

(

a

') SL

=

- 5 - S -- 1 - + -" 2 - S -- 2 -- - ' S -- 4 ------' 5 -S S

2 a + U 2 - S -" 4 '- - - S -- 8 '-

6

6

(b') SH=

5S4 + 2S2 -sl

sau

5S8 + 2S4 -S2

6 .,...

6

și în mod similar pentru UL și UH. Liniile alternative cele mai potrivite

trebuie să fie verificate pentru paralelism ca mai

înainte. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele, trebuie să fie notat în raportul final·(buletinul de analiză).

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activității relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule

(c)

log A=

(u

,

+u

2

+u4

+U

8

-s, -s

2

-S

4

-S

8

)xo,602

U

4

+U 8

+S 4

+S 8

-u

1

-u

2

-s,-s

2

Pentru trei nivele

(d)

log A=

(u, +U2 +U4

-S\

-S2 -SJx0,401

U

4

+S 4

-U 1

-S 1

sau

(d') log A=

(U

2

+U4 +U

g

-s, -s

4

-S

s

)x0,401

U 8 +S 8 -U 2 -S 2

Activitate reală = activitate presupusă X activitate relativă Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se

repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, se

calculează logaritmul activității relative (log. A) prin intermediul formulei (c). Rezultatul obținut trebuie totuși să fie considerat ca aproximativ

și acesta trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză).

1 o.

Repetabilitate

Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate

pe

aceeași

'

probă

prin

aceeași

analiză

nu

trebuie

să depășească:

-

0,5

mg/kg,

în

valoare

absolută,

pentru

conținutul

de flavofosfolipol de la 1 până la 2 mg /kg

-

25% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conținut mai mare de 2 și până la 1O mg/kg

-

20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conținut mai mare de 1O și până la 25 mg/kg,

-

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut mai mare de 25 mg/kg și până la 50 mg/kg, 10% fiind corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conținut de aproximativ 50 mg/kg

3.

Determinarea oligoelementelor: fier, cupru, mangan și zinc

1.

Domeniu și scop

Metoda face posibil să se determine oligoelementele fier, cupru,

mangan

și

zinc

din

furaje.

Limitele

inferioare

de determinare sunt:

Fier (fe): 20 mg/kg Cupru (cu): 1O mg/KG Mangan (mn): 20mg/kg Zinc (zn): 20 mg/kg

2.

Principiu

Proba este introdusă în soluție de acid clorhidric după distrugerea materiilor organice, dacă este cazul. Elementele fier, cupru, mangan și zinc sunt determinate după o diluare corespunzătoare, prin spectrometrie de absorbție atomică.

3.

Reactivi

Comentarii introductive

Pentru

prepararea

reactivilor

și

soluțiilor

analitice

se utilizează

apă liberă de cationii

ce trebuie,

în consecință, determinați, obținută fie prin distilare dublă a apei într-o sticlă de borosilicat

sau

cuarț

sau

prin

tratament

dublu

pe

rășină schimbătoare de ioni.

Reactivii

trebuie

să

fie

de

același

grad

analitic(p.a). Eliberarea elementului ce trebuie determinat trebuie să fie determinată

printr-un experiment ăorb". Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificați ulterior.

în locul soluțiilor standard, descrise mai jos, pot fi utilizate solutii comerciale

standard, cu conditia ca acestea să fie

gara ' ntate și verificate înainte de utilizare. '

3.1 Acid clorhidric p.a.(d: 1.19}

3.2.

Acid clorhidirc p.a. (6N).

3.3.

Acid clorhidric p.a. (0.5 N)

3.4.

Acid fluorhidric 38 la 40

%,

(v/v) având un conținut de fier mai mic de 1

mg Fe/litru și un reziduu după evaporare mai mic de 1O mg (ca sulfat)/litru.

3.5.

Acid sulfuric p.a. (d: 1.84.)

3.6.

Peroxid de hidrogen p.a. 30%

3.7.

Soluție de fier standard (1OOOug Fe/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1g de sârmă de fier p.a. în 200 ml de acid clorhidric 6 n (3.2), se adaugă 16 ml de peroxid de hidrogen (3.6) și se aduce la un litru cu apă

3.7.1.

Soluția de fier standard de lucru (1OO □ g Fe / ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.7) 1/9 cu apă.

3.8.

Soluția de cupru standard (1OOO

□ g Cu / ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de cupru sub formă de pulbere (p.a) în 25 ml de acid clorhidric 6 n (3.2), se adaugă 5 ml de peroxid de hidrogen (3.6) și se aduce la un litru cu apă.

3.8.1.

Soluția standard de cupru de lucru (1O

□ g Cu /ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.8) 1/9 cu apă și apoi prin diluarea soluției ce rezultă 1/9 cu apă.

3.9.

Soluție

standard

de mangan

(1 OOO

ug mn/ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de mangan sub formă de pulbere (p.a) în 25 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) și se aduce la un litru cu apă.

3.9.1.

Soluția standard de mangan de lucru (1O

□ g Mn /ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.9) 1 / 9 cu apă și apoi se diluează soluția ce rezultă 1 / 9 cu apă.

3.1O Soluția standard de zinc (1OOO

□ g Zn / ml) preparată după cum urmează: se dizolvă 1g de zinc sub formă de folie (p.a) în 25 ml de acid clorhidric 6n (3.2) și se aduce la un litru cu apă.

3.10.1 Soluția standard de zinc de lucru (1O

□ g Zn /ml) preparată prin diluarea soluției standard (3.1O) 1/9 cu apă și apoi diluarea soluției ce rezultă 1/ 9 cu apă.

3.11

Soluție de clorură de lantan preparată după cum urmează: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă,

se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) și se aduce la un litru cu apă.

4.

Aparatură

4.1.

Cuptor

cu

muflă

cu

temperatură

reglabilă

șI înregistrare

4.2.

Sticlăria trebuie să fie rezistentă, de tip borosilicat și se recomandă să se utilizeze aparate ce sunt rezervate în mod exclusiv pentru determinări de oligoelemente.

4.3.

Creuzete de platină și creuzete de cuarț

4.4.

Spectrometru

de

absorbție

atomică

ce

întrunește cerințele metodei cu privire la sensibilitatea și precizia gamei de valori solicitate.

5.

Procedură

5.1.

Probe ce conțin materie organică

5.1.1.

Incinerarea și prepararea soluției pentru analiză

(*)

(i)

se

pun 5 până la 1O g de probă, cântărită cu o aproximație de O ,2 mg, într-un creuzet de cuarț sau platină (4.3) (vezi nota(b)), se sicatează într-un cuptor la 105 °C și se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă rece (4.1). Se închide cuptorul (vezi nota (c)) și se ridică în mod gradat temperatura de la 450 la 475

QC

timp de aproximativ 90 minute. Se menține această temperatură timp de 4 până la

16

ore (de ex. peste noapte) pentru a se îndepărta materialul carbonatat și apoi se deschide cuptorul și se lasă să se răcească (vezi nota (d.))

Se spală creuzetul cu un total de aproximativ 5 ml de acid clorhidric (3.1) și acesta din urmă se adaugă încet și cu atenție în capsula (poate surveni o reacție viguroasă datorită formării de CO 2 ). Se adaugă acidul clorhidric

(3.1) sub formă de picătură, cu agitare până când se stopează toată efervescența. Se evaporă la sec, amestecând din când în când cu o bagheta de sticlă.

(*) Este posibil ca furajul verde (proaspăt sau uscat) să conțină o cantitate mare de siliciu vegetal, ce poate reține oligoelemente și trebuie să fie, de aceea, îndepărtat. Pentru probe din aceste furaje, deci, trebuie să fie urmată următoarea procedură modificată

Se efectuează operațiunea 5.1.1 (I) până la filtrare. Se spală hârtia de filtru ce conține reziduul ·insolubil, de două ori, cu apă fiartă și se pune într-un creuzet din platină (4.3.). Se dă foc furnalului cu muflă (4.1) la o temperatură mai mică de 550

°C până când tot materialul carbonatat a dispărut complet. Se lasă să se răcească, se adaugă câteva picături de apă, apoi se adaugă între 1O - 15 ml de acid fluorhidric (3.4) și se evaporă până la uscare, la aproximativ 150 °C. Dacă mai rămâne siliciu în reziduu, se dizolvă în câțiva mililitri de acid fluorhidric (3.4) și se evaporă până la uscare. Se adaugă cinci picături de acid sulfuric (3.5) și se încălzește până când nu mai este degajat nici un vapor alb. După adăugarea a 5 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) și aproximativ 30 ml de apă, se încălzește, se filtrează soluția într-un balon gradat de 250 ml și se umple până la semn cu apă (concentrație

de

acid

clorhidric

aproximativ

0,5n).

Se procedează apoi cu determinarea de la punctul 5.1.3.

Apoi se adaugă 15 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) la reziduul rezultat urmat de aproximativ

120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă ce trebuie să fie lăsată în capsula și se acoperă capsula cu o sticlă de ceas. Se aduce ușor la fierbere și se menține la punctul de fierbere până când se observă că nu se mai dizolvă. Se filtrează cenușa cu hârtie de filtrare și se colectează filtratul într-un balon gradat, se spală capsula și se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6n fierbinte (3.2) și de două ori cu apă fiartă. Se completează balonul gradat până la semn cu apă (concentrație de HCI aproximativ 0.5 N).

(ii)

dacă

reziduul

din filtru apare

negru (particule

de carbon), se pune înapoi în cuptor și se incinerează din nou la 450 până la 475 °C . Această incinerare, ce solicită doar câteva ore (aproximativ trei până la cinci ore), se realizează până când cenușa pare albă sau aproape albă. Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric (3.1), se evaporă până la sec și se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6N (3.2). se încălzește, se filtrează soluția în balonul gradat și se completează până la semn cu apă.

Zinc

µg Zn/ml

o

0.05

0.1

0.2 .

0.4

0.6

0.8

ml solutie standard

d '

e

lucru (3.8.1)

(1 ml

=

1O µg Zn) +ml

6N

HCI

o

7

0.5

7

1

7

2

7

4

7

6

7

8

7

+1O ml de soluție de clor lantan (3.11) și se completează până la 100 ml cu apă.

5.1.2.2.

Prepararea soluției pentru analiză

Pentru determinarea de cupru, soluția preparată ca la punctul 5.1.1. poate fi utilizată, în mod normal, direct. Dacă este necesar să se aducă concentrația în cadrul gamei soluțiilor de calibrare,

o porțiune alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat și se completează până la semn cu acid clorhidric 0.5 n. (3.3).

Pentru determinarea de fier, mangan și zinc, se pipetează o porțiune alicotă din soluția preparată la punctul 5.1.1. într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 1O ml de soluție de clor lantan (3.11) și se completează până la semn cu acid clorhidric

11

0.5 n (3.3) (vezi, de asemenea, punctul 8 observație")

5.1.2.3.

Experiment ăorb"

Experimentul

11 orb"

trebuie

să

includă

toate

etapele prescrise de procedură, cu excepția faptului că materialul de probă este omis.

Solutia de calibrare

11

'

0 11

nu trebuie să fie utilizată ca ăorb".

5.1.2.4.

Măsurarea absorbtiei atomice

'

Se măsoară absorbția atomică a soluțiilor de calibrare și a

solutiei ce trebuie analizată, utilizându-se o flacara oxidantă de aer-a '

cetilenă la următoarele lungimi de undă:

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.185 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Articolul 3

— Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 17.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 17/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări

METODA DE CALCUL

a valorii energetice a furajelor pentru păsări

ANEXĂ

la norma veterinară

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial

al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr,

uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.878 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art.

3.

—

Agenția

Veterinară

și

pentru

Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prevederilor prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 18.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 18/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor

cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice

a produselor derivate din soia

ANEXĂ

la norma veterinară

controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute"

3.

Procedură

Se amestecă bine proba finală, fie mecanic sau manual. Se împarte proba în două părți egale (poate să fie utilizată metoda de împărțire în patru când este cazul). Se menține una din porțiuni într-un container corespunzător, curat și uscat, echipat cu un dop etanș și se pregătesc din cealaltă porțiune sau dintr-o porțiune reprezentativă a acesteia, cel puțin 100g, așa cum s-a indicat mai jos.

3.1.

Furaje ce pot fi măcinate ca atare

Cu excepția cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză, după măcinare, dacă e necesar, se cerne întreaga probă printr-o sită cu ochiuri de 1mm (în conformitate cu Recomandarea ISO R 565). Se evită orice supra-măcinare.

Se amestecă proba măcinată și se colectează într-un container corespunzător, curat și uscat, echipat cu un dop etanș. Se amestecă din nou, imediat înainte de cântărirea cantității pentru analiză.

3.2.

Furaje ce pot fi măcinate după uscare

Cu excepția cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză,

se usucă proba

pentru a se aduce conținutul

în umiditate

al

acesteia

la

un

nivel

scăzut

de

8-12%,

în conformitate cu procedura preliminară de uscare descrisă în baza punctului 4.3. al metodei de determinare

a umidității menționată la secțiunea 2 de mai sus. Se procedează apoi așa cum s-a indicat la sectiunea 3.1.

3.3.

Furaje lichide sau '

semi-lichide

Se colectează proba într-un container corespunzător, curat și uscat, echipat cu un dop etanș. Se amestecă bine imediat înainte de cântărirea cantității pentru analiză.

3.4.

Alte furaje

Probele ce nu pot fi preparate în conformitate cu una din procedurile

anterioare

trebuie să fie tratate prin orice altă procedură ce asigură că, în fapt, cantitățile cântărite pentru analiză sunt omogene și reprezentative pentru probele finale.

4.

Depozitarea probelor

Probele trebuie să fie depozitate la o temperatură ce nu va

altera compoziția acestora. Probele destinate pentru analiza vitaminelor sau a substantelor ce sunt sensibile în mod deosebit

la lumină, trebuie să fie

' depozitate în containere cu geamuri

fumurii.

B. Prevederi în legătură cu reactivii și aparatura utilizată la metodele de analiză.

1.

Numai dacă nu s-a specificat la metodele de analiză, toți reactivi analitici trebuie să fie puri din punct de vedere analitic.(a.p.). Când se determină micro-elemente, puritatea reactivilor

trebuie să fie controlată printr-un test martor. În funcție

de

rezultatele

obținute,

poate

să

fie

necesară

o purificare suplimentară a reactivilor.

2.

Orice

operațiune

ce

implică

pregătirea

soluțiilor, diluarea, clătirea sau spălarea, menționate de metodele de analiză, fără indicație în ceea ce privește natura solventului sau a diluantului întrebuințat, implică faptul, că trebuie să fie utilizată apă. Ca regulă generală, apa trebuie să fie demineralizată sau distilată. În cazuri particulare ce sunt indicate de metodele de analiză, aceasta trebuie să fie supusă unor proceduri speciale de purificare.

3.

În legătură cu echipamentul aflat în mod normal în

laboratoarele de control metodele de analiză fac referire numai la acele instrumente sau aparate ce sunt speciale sau necesită utilizare specifică. Acestea trebuie să fie curate, în special

atunci când trebuie să fie determinate cantităti foarte mici de

substante.

'

'

C. Aplicarea metodelor de analiză și exprimarea rezultatelor

1.

Este stabilită, în general, o singură metodă de analiză pentru determinarea fiecărei substanțe din furaje. Atunci când sunt prezentate câteva metode, trebuie să fie indicată, în raportul de analiză, metoda specifică utilizată de laboratorul de control.

2.

Rezultatul prezentat de raportul de analiză trebuie să fie valoarea medie obținută de la cel puțin două determinări,

efectuate pe porțiuni separate de probă și de o repetabilitate satisfăcătoare.

Acest rezultat trebuie să fie exprimat în maniera stabilită de metoda de analiză, cu un număr corespunzător de cifre semnificative și trebuie să fie corectat, dacă este necesar, în funcție de conținutul

de umiditate

al probei finale anterior preparării.

Pregătirea probei pentru analiză

Este esențial ca analizele chimice să fie efectuate pe o probă omogenă. Este totuși posibil să se efectueze unele determinări macroscopice sau microscopice și de asemenea, determinarea umidității, din probă în starea în care aceasta ajunge la laborator. Pentru a satisface aceste două cerințe, proba va fi divizată în două părți. O parte va fi păstrată așa cum este, iar cealaltă poate va fi preparată pentru analiză chimică, după cum urmează. Se divide proba cu aparatură mecanică sau manual, după amestecarea cu grijă a întregii probe pe o suprafață curată și uscată. În caz extrem este preferabil să se utilizeze metoda de divizare în sferturi ce constă în prelevarea de probe pe rând din două secțiuni opuse. În cele din urmă se delimitează pentru analiză o porțiune ce cântărește aproximativ 100g și dacă e necesar, aceasta se mărunțește, astfel încât întreaga probă trece printr-o

sită cu ochiuri de 1mm. Se transferă imediat această probă într-un container uscat, etanș și se sigilează.

Dacă proba este foarte umedă, aceasta trebuie să fie pre­ uscată, pentru a se aduce conținutul umidității la un nivel scăzut, între 8 și 12%. Pentru a se realiza aceasta, se usucă proba la o temperatură potrivită pentru o perioadă de timp adecvată.

Reactivi și aparatură

La descrierea metodelor de analiză sunt mentionate numai

instrumente

sau

aparate

speciale

sau

cele

'

ce

necesită

standarde speciale. Nu se consideră necesar să se menționeze

toate aparatele sau instrumentele ce fac parte din echipamentul de zi cu zi al laboratoarelor de testare.

De

asemenea,

acolo

unde

este

menționată

apa,

în legătură cu realizarea diluării sau spălării, aceasta înseamnă apă distilată. În mod similar, acolo unde este menționată soluția

unui reactiv, fără orice altă indicatie, aceasta înseamnă o

soluție în apă distilată.

'

E primarea rezultatelor

Rezultatul specificat de certificatul de analiză trebuie să fie valoarea medie obținută pe baza a cel puțin două testări. Supus unor prevederi speciale, acesta trebuie să fie exprimat ca un procentaj din proba originală, așa cum a fost când acesta a ajuns la laborator. Nu trebuie să fie prezentat rezultatul cu cifre mai semnificative decât permite acuratețea metodei de analiză.

2.

Determinarea acidului cianhidric

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această

metodă

face

posibilă

determinarea

nivelului acidului cianhidric, liber și combinat sub forma glicozidelor, în furaje și în particular în produse derivate din semințe de in, din făină de manioc și din unele specii de fasole.

2.

Principiu

Proba este suspendată

în apă. Acidul cianhidric este eliberat prin acțiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu aburi și colectat într-un volum specific de soluție acidifiată de nitrat de argint. Cianura de argint este separată prin filtrare, iar excesul de nitrat de argint este titrat cu o soluție de tiocianat de amoniu.

3.

Reactivi

3.1.

O suspensie de migdale dulci: se zdrobesc 20 de migdale

dulci confiate

în 100 ml de apă la 37-40°C.

Se controlează

să

nu existe

acid cianhidric

în cei

1O ml ai suspensiei, utilizând hârtie de picrat de sodiu sau efectuând un test martor, așa cum este descris la ultimul paragraf al punctului

5.

3.2.

10°/o soluție (w/v) de acetat de sodiu, neutră la fenolftaleină.

3.3.

Emulsie anti-spumă (e.g. Silicon)

3.4.

Acid azotic, d20=1,4Og/ml

3.5.

Soluție de azotat de argint: O,O2N

3.6.

Solutie de tiocianat de amoniu: O,O2N.

3.7.

Solut ' ie saturată de sulfat feric de amoniu.

3.8.

Amon '

iac, d20 = O,958g/ml.

4.

Aparatură

4.1.

Cuptor cu termostat fixat la 38°C.

4.2.

Aparat pentru distilare prin antrenare cu aburi, echipat cu un refrigerent cu o piesă extinsă curbată.

4.3.

Baloane de 1000ml cu fundul plat cu dop de sticlă

4.4.

Baie de ulei

4.5.

Biurete gradate de 1120ml.

5.

Procedură

Se cântăresc 2Og din probă, cu o aproximație de 5mg, se introduc într-un balon cu fund plat de 1000ml și se adaugă 50ml de apă și 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1). Se pune dopul la balon și se transferă în cuptor, timp de 16ore la 38°C. Se răcește apoi la temperatura camerei și se adaugă 80ml de apă, 10ml de soluție de acetat de sodiu(3.2) și o picătură din emulsia anti-spumă (3.3).

Se

conectează

balonul

la aparatul

de distilare

și se introduce într-o baie de ulei ce a fost mai întâi adusă la o

temperatură cu puțin peste 1 oo 0 c.

Se distila 200ml până la

300ml de lichid, trecând un puternic curent de aburi prin balon și încălzind ușor baia de ulei. Se colectează distilatul într-un pahar Erlenmeyer protejat de lumină și care conține exact 50ml de soluție de azotat de argint O,O2N (3.5) și 1ml de acid azotic (3.4).

Trebuie

să

se

asigure

că

tubul

prelungitor

al refrigerentului este imersat într-o soluție de nitrat de argint.

Se transferă conținutul din paharul Erlenmeyer

într-un balon

cotat

de

500ml,

se

completează

cu

apă,

se omogenizeaza și se filtrează. Se iau 250ml din filtrat, se adaugă aproximativ 1ml de soluție de sulfat feric de amoniu (3.7) și se titrează înapoi excesul de nitrat de argint cu soluție de tiocianat

de amoniu 0,02N (3.6)provenita dintr-o biuretă gradată de 1120ml.

Un test martor poate să fie efectuat, dacă este necesar,

aplicând aceeași procedură la 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1), omițând că proba trebuie analizată.

6.

Calcularea rezultatelor

Dacă testul martor indică faptul că soluția de azotat de argint 0,02 n a fost consumată, se scade valoarea acesteia din volumul consumat de distilatul probei. 1ml de AgNO3 0,02 n corespunde

la

0,54

mg

de

HCN.

Se

exprimă

rezultatul procentual.

7.

Observatii

Dacă

' proba conține o cantitate mare de sulfiți (ex. boabe

de fasole}, se formează un precipitat negru de sulfit de argint ce este filtrat

împreună

cu un depozit

de cianură

de argint. Formarea acestui precipitat cauzează o pierdere de soluție de nitrat de argint 0,02n, volum ce trebuie să fie scăzut din volumul utilizat pentru a calcula conținutul de HCN. Pentru a face aceasta, se procedează după cum urmează:

Se tratează

depozitul

rămas pe un filtru cu 50ml de amoniac (3.8), pentru a se dizolva cianura de argint. Se spală reziduul în amoniac diluat și apoi se determină conținutul în argint al acestuia. Se convertește valoarea obținută în ml de soluție de azotat de argint 0,02 N.

Conținutul

în HCN al probei poate fi, de asemenea, determinat prin titrarea filtratului amoniacal acidifiat, cu acid azotic.

3.

Determinarea calciului

1.

Scop și domeniu de aplicare

Metoda face posibilă determinarea calciului total din furaje.

2.

Principiu

Proba de analizat este calcinata, cenușa tratată cu acid clorhidric, iar calciul precipitat sub forma de oxalat de calciu. Se dizolvă precipitatul în acid sulfuric și se titrează acidul oxalic ce se formează cu o solutie de permanganat de potasiu.

'

'

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric p.a., d20=1,14g/ml

3.2.

Acid azotic p.a.,d 20= 1,40 g/ml

3.3.

Acid sulfuric p.a., d20= 1,13 g/ml

3.4.

Amoniac p.a., d20=O,89 g/ml

l

3.5.

Solutie saturată la rece de oxalat de amoniu p.a..

3.6.

Soluție 3O°/c, (w/v) de acid citric p.a..

3.7.

Soluție 5°/o (w/v) de clorură de amoniu p.a.

3.8.

Soluție 0,04% (w/v) de verde brom crezol

3.9.

Soluție de permanganat de potasiu O,1n

4.

Aparatură

4.1.

Cuptor electric cu circulație a aerului și termostat.

4.2.

Creuzete

din

platină,

siliciu

sau

porțelan

pentru calcinare.

4.3.

Creuzete filtrante cu frita din sticlă de porozitate

G4.

4.4.

Baie de apa.

5.

Procedura

Se cântăresc aproximativ 5g din probă (sau mai mult dacă este necesar) cu o precizie de 1 mg, se calcinează la 55O°c și se transferă cenușa într-un pahar de laborator de 250ml.

Se adaugă 40ml de acid clorhidric (3.1), 60ml de apă și câteva picături de acid azotic (3.2). Se aduce la fierbere și se menține la punctul de fierbere timp de 30 de minute. Se răcește și se transferă soluția într-un balon cotat de 250ml. Se clătește, se completeaza

la semn cu apa, se omogenizează

și se filtrează.

Utilizând o pipetă, se transferă într-un pahar de laborator de 250ml, o cantitate ce conține 1O până la 40mg de calciu, în conformitate cu conținutul în calciu asumat. Se adaugă 1ml de soluție de acid citric (3.6) și 5ml de soluție de clorură de amoniu (3.7).

5.

Se dilueaza cu apă volumul până la aproximativ 100ml.

Se aduce până la punctul de fierbere, se adaugă 8 până la 1O picături de soluție de verde brom crezol (3.8) și 30ml de soluție fierbinte de oxalat de amoniu (3.5). Dacă se formează un precipitat, acesta se dizolvă adăugând câteva picături de acid clorhidric (3.1).

Se

neutralizează

lent

cu

amoniac

(3.4),

sub

agitare constanta până la obtinerea unui

pH de 4.4 pana la 4.6 (ex.: Atunci când indicatorul

își schimbă culoarea). Se plasează paharul de laborator într-o baie de apă la fierbere și se mentine timp de 30 de minute, pentru a permite precipitatului ce s-a format să se depună. Se scoate paharul de laborator din baia de apă. Se lasă ca acesta să stea timp de o oră și se filtrează printr-un creuzet filtrant tip G4.

Se spală paharul de laborator și creuzetul cu apa pana la eliminarea completa a excesului de oxalat de amoniu, constatat prin absenta ionului clor in apa de spalare

Se dizolvă precipitatul de pe filtru în 50ml de acid sulfuric fierbinte (3.3). Se clătește creuzetul cu apă fierbinte și se

completează filtratul până la aproximativ 100ml. Se aduce temperatura până la 70-ao 0

c

și se titrează picătură cu picătură cu o soluție de permanganat de potasiu (3.9) până când este

obținută o culoare roz ce durează timp de 1 minut.

6.

Calcularea rezultatelor

1ml de permanganat de potasiu O,1 n corespunde la 2,004 mg de calciu. Se exprimă rezultatul obținut procentual.

7.

Observatii

7.1.

P '

entru

un

continut

foarte

scăzut

de

calciu

se

procedează după cum urm '

ează: se filtrează precipitatul de

oxalat de calciu printr-o hârtie de filtru liberă de cenușă. După spălare se usucă filtrul și cenușa la

sso 0 c

într-un creuzet de platină. Se redizolvă reziduul în câteva picături de acid

sulfuric

(3.3), se evaporă până la sec, se calcinează din nou la 550°C și se cântărește.

Dacă w este greutatea

sulfatului

de calciu obținut, conținutul în calciu a cantității luată ca o probă

=

W x 0,2944.

7.2 Dacă proba constă numai din substante minerale,

I

A

aceasta se dizolvă în acid clorhidric fără a o calcina mai întâi. ln

cazul produselor precum fosfatul de aluminocalcic ce este dificil de dizolvat în acid, se dizolvă după cum urmează printr-un proces alcalin înainte de dizolvare: se amestecă bine proba ce trebuie analizată într-un creuzet de platină cu un amestec de cinci ori greutatea acesteia, constând în cantități egale de carbonat de potasiu și carbonat de sodiu. Se încălzește cu grijă

până când amestecul este dizolvat complet. Se răcește și se dizolvă în acid clorhidric.

7.3. Se precipită oxalatul de calciu a doua oară, dacă conținutul în magneziu al probei este ridicat.

4.

Determinarea carbonatilor

'

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de carbonați, exprimată convențional ca și carbonat de calciu în majoritatea furajelor.

Totuși, în unele cazuri, trebuie să fie utilizată o metodă specială (de ex.: cu carbonat de fier).

2.

Principiu

Carbonații sunt descompuși în acid clorhidric.

Dioxidul de carbon eliberat este colectat într-un tub gradat, iar volumul acestuia comparat

cu cel eliberat în aceleași condiții, printr-o cantitate cunoscută de carbonat de calciu p.a.

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric, d=1,1Og/ml.

3.2.

Carbonat de calciu, p.a

3.3.

Acid sulfuric, aproximativ O,1n, colorat cu roșu metil.

4.

Aparatură

Aparatură

Scheibler

-

Dietrich

(vezi

diagrama)

sau aparatura echivalentă.

5.

Procedura

în conformitate cu conținutul în carbonați al probei, se cântărește o porțiune a probei, așa cum se arata în continuare: 0,5g pentru produse ce conțin de la 50 la 100% carbonați, exprimați ca și carbonat de calciu

1g pentru produse ce conțin de la 40 la 50% carbonați, exprimați ca și carbonat de calciu.

2-3g pentru alte produse.

Se plasează porțiunea probei într-un recipient special (4) a aparaturii, echipată cu un tub mic din material indestructibil ce conține

1O

ml

de

acid

clorhidric

(3.1)

și

se

conectează recipientul la aparatură. Se deschide

robinetul cu trei căi (5), astfel încât tubul(1) se conectează cu exteriorul. Se aduce

nivelul lichidului la nivelul de sus, până la semnul zero, utilizând tubul mobil (2) ce este plin cu acid sulfuric colorat (3.3) și conectat la tubul gradat (1). Se deschide

robinetul pentru a se conecta tuburile (1) și (3) și se verifică dacă nivelul este la zero.

Se dă drumul încet la acid clorhidric (3.1) peste porțiunea

de probă, aplecând recipientul(4). Se egalizează presiunea coborând tubul

(2);

Se agită recipientul (4) până când se oprește complet eliberarea de dioxid de carbon.

Se restaurează presiunea aducând lichidul din tuburile (1) și (2) înapoi la același nivel. Se citește după câteva minute, atunci când volumul de gaz a devenit constant.

Se efectuează un test de control în aceleași condiții pe 0,5g de carbonat de calciu (3.2).

6.

Calcularea rezultatelor

Conținutul de carbonați în grame, exprimat ca și carbonat de calciu, ca procent din probă, este calculat utilizând formula:

Vx100

Tx2W

unde:

V=ml de CO2

T =

greutatea în grame a porțiunii de probă W= greutatea în grame a porțiunii de probă

7.

Observatii

7.1.

At '

unci când porțiunea din probă cântărește mai mult

de 2g,

se plasează

mai

întâi 15ml

de apă

distilată

în recipient(4) și se amestecă înainte de a începe testarea. Se utilizează același volum de apă pentru testul de control.

7.2.

Dacă aparatura utilizată are un volum diferit de cel al aparatului Scheibler - Dietrich, porțiunile prelevate din probă și din substanța de control și calcularea rezultatelor trebuie să fie adaptate în consecință.

5.

Determinarea cenușii brute

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibilă determinarea conținutului de cenușă brută al furajelor.

2.

Principiu

Proba este calcinată la 550°C; este cantarit rezidiul.

3.

Reactivi

Soluție 20°/o (w/v) de azotat de amoniu.

4.

Aparatură

4.1.

Plita încinsă;

4.2.

Cuptor electric cu termostat.

4.3.

Creuzete pentru calcinare confecționate din platină sau dintr-un aliaj din platină și aur (10%Pt, 90% Au), fie rectangular

(60x40x25mm)

fie circular (diametru: 60-75mm, înălțime: 20-25mm).

5.

Procedură

Se cântărește proba cu o marjă de aproximativ 5g (2,5 în cazul produselor ce au tendința de a crește în volum) și se plasează

într-un

creuzet

pentru

calcinare

ce inițial

a fost calcinat și tarat. Se plasează creuzetul pe plita de incalzire

și se încălzește treptat până când substanța se carbonizează. Se pune creuzetul într-un cuptor fixat la

550+5°C.

Se menține la această temperatură până când este obținută o cenușă albă, gri deschis sau roșiatică ce pare a fi liberă de particule de cărbune. Se plasează creuzetul într-un exsicator, se lasă să se răcească și se cântărește imediat.

6.

Calcularea rezultatelor

Se calculează cantitatea de reziduu scazand tara. Se exprimă rezultatul procentual.

7.

Observatii

7.1.

Ce '

nușa substanțelor ce sunt dificil de calcinat trebuie

să fie supusă unei calcinări inițiale de cel puțin trei ore, răcită și apoi se adaugă la aceasta (cu grijă, pentru a se evita dispersia cenușii sau formarea

de bulgări)

câteva picături de soluție 20% de azotat de amoniu. Se continuă calcinarea după uscare în cuptor. Se repetă operațiunea cât este necesar, până când este încheiată calcinarea.

7.2.

în cazul substantelor rezistente la tratamentul descris în baza punctului 7 .1.,

se p ' rocedează după cum urmează: după

o calcinare de trei ore, se plasează cenușa în apă fierbinte și se filtrează printr-un filtru mi , c, liber de cenușă. Se calcinează filtrul și conținutul acestuia în creuzetul inițial. Se plasează filtratul în

creuzetul răcit, se evaporă până la sec, se calcinează și se cântărește.

7.3.

În cazul uleiurilor și al grăsimilor, se cântărește cu acuratețe o probă de aproximativ 25 de g într-un creuzet de mărime potrivită. Se carbonizeaza fixând resturile substanței cu o bucată de hârtie de filtru liberă de cenușă. După ardere, se umezește cu cât de puțină apă este posibil. Se usucă și se calcinează, așa cum s-a descris în baza punctului 5.

6.

Determinarea cenușii, insolubilă

in

acid clorhidric

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine nivelul de substante minerale ce sunt insolubile în acid clorhidric din

furaje. P ' ot fi utilizate două metode, depinzând de natura probei.

1.1.

Metoda A : aplicabilă furajelor organice simple și majorității furajelor combinate

1.2.

Metoda

B

aplicabilă

compușilor

minerali

și amestecurilor și furajelor combinate al căror conținut în substanțe insolubile în acid clorhidric, așa cum s-a determinat prin metoda a, este mai mare de 1 %.

2.

Principiu

2.1.

Metoda a: proba este calcinată, cenușa este tratata la cald acid clorhidric si adusa apoi la fierbere, iar reziduul insolubil este filtrat și cântărit.

2.2.

Metoda b: proba este tratată cu acid clorhidric. Soluția este filtrată, reziduul calcinat, iar cenușa astfel obținută tratată în conformitate cu metoda A.

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric 3n.

3.2.

20% (w/v) soluție de acid tricloracetic.

3.3.

1% (w/v) soluție de acid tricloracetic.

4.

Aparatură

4.1.

Plita încinsă

4.2.

Cuptor electric cu termostat.

4.3.

Creuzete pentru calcinare din platină sau un aliaj din platină și aur (10% Pt, 90% Au), fie rectangular (60x40x25mm) fie circular (diametru: 60-75mm, înălțime: 20-25mm).

5.

Procedură

5.1.

Metoda A:

Se calcinează proba utilizându-se metoda descrisă pentru determinarea cenușii brute. Poate fi, de asemenea, utilizată cenușa obținută din acea analiză.

Se plasează cenușa într-un pahar de laborator, utilizându­ se 75ml de acid clorhidric (3.1). Se aduce încet si se mentine in fierbere inceata timp de 15 minute. Se filtrează soluția fierbinte printr-o hârtie de filtru liberă de cenușă și se spală reziduul cu apă fierbinte până când nu mai este vizibilă reacția acidă. Se usucă filtrul ce cantine reziduul si cenusa într-un creuzet tarat in prealabil la o temp'eratură de nu mai puțin de 550°C și nu mai mult de 700°C. Se răcește într-un exsicator și se cântărește.

5.2.

Metoda B

Se cântăresc 5g din probă cu o aproximație de 1mg și se plasează într-un pahar de laborator de 250-400ml. Se adaugă succesiv 25ml de apă și 25ml de acid clorhidric 3n (3.1), se amestecă și se așteaptă să înceteze efervescența. Se adaugă încă 50ml de acid clorhidric 3N (3.1). Se așteaptă să înceteze orice eliberare de gaz, apoi se plasează paharul de laborator într-o baie cu apă ce fierbe și acesta se menține acolo timp de 30 de minute sau mai mult, dacă este necesar, pentru a se hidroliza bine amidonul ce poate fi prezent.

Se filtrează, în timp ce se încălzește, printr-un filtru liber de

cenușă

și

se spală

filtrul

cu 50ml

de apă fierbinte

(vezi observația 7). Se plasează filtrul ce conține reziduul într-un creuzet

pentru

calcinare,

se usucă

și se calcinează

la o temperatură nu mai scăzută de 550°C și nu mai mult de 700°C. Se plasează cenușa într-un pahar de 250-400ml, utilizându-se 75ml de acid clorhidric 3n (3.1). Se continuă așa cum s-a descris la al doilea subparagraf al punctului 5.1.

6.

Calcularea rezultatelor

Se calculează cantitatea de cenusa insolubila deducand tara. Se exprimă rezultatul procentual.

7.

Observatii

Dacă

'

filtrarea se dovedește dificilă, se reîncepe analiza,

înlocuind cei 50ml de acid clorhidric 3N (3.1) cu 50ml de acid

tricloracetic (3.2.) și spălând filtrul într-o soluție fierbinte de acid tricloracetic (3.3).

7.

Determinarea clorului din cloruri

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de clor din cloruri ce sunt solubile în apă, exprimate convențional ca și clorură de sodiu. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor.

2.

Principiu

Clorurile prezente in proba de analizat sunt dizolvate în apă. Dacă produsul conține materie organică,

acesta este clarificat. Soluția este ușor acidifiată cu acid azotic iar clorurile precipită sub formă de clorură de argint, prin intermediul unei soluții de azotat de argint. Azotatul de argint în exces este titrat cu o soluție de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.

3.

Reactivi

3.1.

Soluție de tiocianat de amoniu O,1n.

3.2.

Soluție de azotat de argint O,1 n.

l

3.3.

Solutie saturată de sulfat feric de amoniu.

3.4.

Acid azotic, d20= 1,38g/ml.

3.5.

Eter dietilic p.a.

3.6 Acetonă p.a.

3.7.

Soluție Carrez I: se dizolvă în apă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH 3 COO)2 . 2H2O și 3g de acid acetic glacial. Se completează până la 100ml cu apă.

3.8.

Soluție Carrez li: se dizolvă în apă 10,6g de ferocianat de potasiu K 4 [Fe(CN) 6

]

x3H 2 O. Se completează până la 100ml cu apă.

3.9.

Carbune activ p.a., liber de cloruri și neabsorbant al acestora.

4.

Aparatură

Mixer (amestecator) avand o frecventa de rotatie de cca.

35-40rpm.

5.

Procedură

5.1.

Prepararea soluției

în conformitate cu natura probei, se prepară o soluție, așa cum se specifica la pct. 5.1.1., 5.1.2. sau 5.1.3.

În același timp se efectuează un test martor ce omite proba ce trebuie analizată.

5.1.1.

Probe libere de materie organică. Se cântărește, cu o aproximație de 1mg, o proba de lucu de maxim 10g

si care se presupune a nu cantine mai mult de 3 g cloruri si se introduce

intr-un

balon

cotat

de

500ml

cu

400ml

apa

la temperatura de aproximativ 20°C.Se amestecă timp de 30 de minute în amestecator(4.1), se completeaza la semn cu apa , se omogenizează și se filtrează.

5.1.2.

Probe ce conțin substante

organice,

excluzând produsele listate în baza punctului 5.1.3. Se cântăresc cu o precizie de 1mg, o proba de lucru de cca. 5g și se introduc cu 1 g de carbune activ într-un balon cotat de 500ml. Se adaugă 400ml de apă la aproximativ 20°c și 5ml de soluție Carrez I (3.7), se agită și apoi se adaugă 5ml de soluție Carrez

li

(3.8). Se amestecă timp de 30 de minute în amestecatorul (4.1), se completeaza la semn cu apa, se omogenizează și se filtrează.

5.1.3.

Furaje preparate, sroturi și făină de in, produse bogate în făină de in și alte produse bogate în mucilagii sau în substanțe coloidale (de exemplu amidon dextrinizatt).

Se prepară soluția așa cum s-a descris la punctul 5.1.2., dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar se centrifughează), se rețin 100ml din lichidul supernatant

și se transferă într-un balon cotat de 200ml. Se amestecă cu acetonă (3.6) și se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează și se filtrează.

5.2.

Titrare

Utilizând o pipetă, se transferă într-un balon Erlenmayer 25-100ml

din filtrat (în conformitate

cu conținutul

de clor

presupus) obținut, așa cum s-a descris în baza punctelor 5.1.1.,

5.1.2 sau 5.1.3. Portiunea

alicota nu trebuie să cantină mai mult de 150mg de C ' I. Se diluează, dacă este necesa ' r, la cel

puțin 50ml cu apă, se adaugă 5ml de acid azotic (3.4), 20ml de soluție saturată de sulfat feric de amoniu (3.3) și două picături de

soluție

de tiocianat

de

amoniu

(3.1)

transferat

prin intermediul unui biurete umplută până la semnul zero. Utilizând o biuretă, se transferă

oluția de azotat de argint (3.2) în așa mod încât este obținut un exces de 5ml. Se adaugă 5ml de

dietil

eter

(3.5)

și

se

agita

puternic

pentru

formarea precipitatului.

Se titrează excesul de azotat de argint cu soluție de

tiocianat de amoniu (3.1) până la obtinerea unei coloratii roșie­ brună persistenta timp de 1 minut.

6.

Calcularea rezultatelor

Cantitatea de clor (w), exprimată ca și clorură de sodiu, prezentă în volumul de filtrat luat pentru titrare, este calculată utilizându-se următoarea formulă:

W=5,845(V1 -V2)mg

unde:

V1= ml de soluție de azotat de argint

O, 1 N adăugată

V2= ml de soluție de tiocianat de amoniu

O, 1 N utilizată pentru titrare.

Dacă testul martor indică faptul că soluția de azotat de argint

O, 1 N a fost consumată, se scade această valoare din volumul (V1- V2).

7.

Observatii

7.1.

T '

itrarea

poate

fi,

de

asemenea,

efectuată

prin potențiometru;

7.2.

În cazul produselor ce sunt foarte bogate în uleiuri și

grăsimi, se realizează o primă degresare cu dietil eter sau eter de petrol

7.3.

În cazul făinii de pește, titrarea poate fi efectuată prin metoda Mohr.

8.

Determinarea uleiului de muștar

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de ulei de muștar conținut în brichete, elaborate de speciile Brassica și Sinapis și din furajele combinate ce conțin brichete obținute de la aceste specii și exprimate ca alil izotiacianat ce poate fi antrenat cu aburi.

2.

Principiu

Proba este suspendată în apă. Uleiul de muștar este eliberat prin acțiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu etanol și colectat cu amoniac diluat. Soluția este tratată, în timp ce se

încălzește, cu un volum precis de soluție de azotat de argint, apoi se răcește și se filtrează. Excesul de azotat de argint este

titrat cu o solutie de tiocianat de amoniu.

3.

Reactivi

'

3.1.

Muștar alb (Sinapis alba).

3.2.

Etanol 95-96% (v/v).

3.3.

Emulsie anti-spumă (de ex. silicon).

3.4.

Amoniac, d 20 =958g/ml

3.5.

Soluție de azotat de argint O,1N.

3.6.

Solutie de tiocianat de amoniu O,1N.

3.7.

Acid

' azotic, d20= 1,4Og/ml

3.8.

Solutie saturată de sulfat feric de amoniu.

4.

Aparatură

'

4.1.

Balon cotat cu fund plat de 500ml, cu dop rodat de sticlă.

4.2.

Aparat de distilat, echipat cu un refrigerent

șI cu echipament pentru prevenirea antrenării picăturilor mici.

5.

Procedură

Se cântăresc

1Og de probă cu o aproximație de 1mg, se plasează într-un balon cotat cu fundul plat de 500ml și se adaugă 2g de muștar alb mărunțit fin (3.1) (o sursă de enzimă) și 200ml de apă la 2O°C.Balonul se menține la 2O°C timp de aproximativ 2 ore și se agită frecvent. Se adaugă 40ml de etanol (3.2) și o picătură de emulsie anti-spumă (3.3). Se distila aproximativ 150ml și se colectează distilatul într-un pahar

ce conține 20ml de amoniac (3.4), fiind sigur că tubul prelulungitor al refrigerentului este imersat în lichid. Se adaugă la soluția amoniacală 50ml de soluție de azotat de argint O,1 N (3.5) (sau mai mult dacă e necesar}, se plasează o mică pâlnie peste pahar

și se încălzește amestecul pe o baie de apă fiartă, timp de o oră. Se lasă să se răcească, se completează la semn cu apă, se omogenizeaza și se filtrează. Se rețin 100ml de filtrat clar, se adaugă 5ml de acid azotic (3.7) și aproximativ 5ml de

solutie de sulfat feric de amoniu. Se titrează,

în schimb, exce ' sul de azotat de argint cu o soluție O,1N de tiocianat de

amoniu (3.6).

Se efectuează un test martor, aplicând aceeași procedură la 2g de muștar alb fin, omițând proba pentru analiză.

6.

Calcularea rezultatelor

Se scade volumul de soluție O,1N de azotat de argint consumat în testul martor din cel consumat de probă în soluție. Valoarea obtinută redă numărul de ml de solutie O,1N de azotat

de argint co '

nsumat de uleiul de muștar din '

probă. 1ml de

AgNO3 O,1N corespunde la 4,956 mg de izotiocianat alil. Se exprimă rezultatul procentual.

9.

DETERMINAREA LACTOZEI

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine nivelul de lactoză din furaje ce conțin mai mult de 0,5% lactoză.

2.

Principiu

Zaharurile sunt dizolvate în apă. Soluția este supusă fermentației cu drojdie de Saccharomyces cerevisiae ce lasă lactoza intactă. După clarificare și filtrare conținutul de lactoză al filtratului este determinat prin metoda Luff-Schoorl.

3.

Reactivi

3.1.

Suspensie

de

Saccharomyces

cerevisiae:

se suspendă

25g

de

drojdie

proaspătă

în

100ml

de

apă. Suspensia

se

va

ține

pentru

o

perioadă

maximă

de

o săptămână, într-un frigider.

3.2.

Soluție Carrez I: se dizolvă în apă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH 3 COO)2 x2H2O și 3g de acid acetic. Se completează până la 100ml cu apă.

3.3.

Soluție

Carrez

li:

se

dizolvă

în

apă

10,6g

de ferocianură de potasiu K 4 [Fe(CN 6

)

]x3H 2 O. Se completează până la 100ml cu apă.

3.4.

Reactiv Luff-Schoorl

ln soluția de carbonat de sodiu(3.4.3)

se adaugă soluție de acid citric (3.4.2) si se agită cu grijă Se adaugă apoi soluția de sulfat de cupru (3.4.1) și se completează până la un litru cu apa.. Se lasă in repaus peste noapte și se filtrează. Se verifica normalitatea reactivului astfel obținut (Cu O,1N; Na2C03 2N). PH-ul soluției trebuie să fie de aproximativ 9,4.

3.4.1.

Soluție de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru p.a. CuSO4 x5H2O, ( fara fier), în 100ml de apă.

3.4.2.

Soluție de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric

p.a C6HaO7 xH2O în 50ml de apă.

3.4.3.

Soluția de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,Bg de carbonat de sodiu anhidru p.a.

în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă să se răcească.

3.5.

Piatră ponce granulată,

fiartă în acid clorhidric, spălată cu apă și uscată.

3.6.

Soluție 30% de iodură de sodiu (w/v).

3.7.

Acid sulfuric 6N.

3.8.

Solutie de tiosulfat de sodiu O,1N.

3.9.

Solu ' ție de amidon: 5g de amidon solubil dizolvat în

30ml de apă se fierbe într-un litru de apă, timp de trei minute. Se lasă să se răcească și dacă este necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ.

4.

Aparatură

Baie de apă cu termostat stabilit la 38-40°C.

5.

Procedură

Se cântărește 1g de probă cu o aproximație de 1mg și se intoduce

într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă 25-30ml de apă. Se plasează balonul într-o baie de apă la fierbere, timp de

30 de minute dupa care se răcește la aproximativ 35°C. Se adaugă 5ml de suspensie de drojdie (3.1) și se omogenizează. Se lasă balonul să stea timp de două ore într-o baie de apă, la o

temperatură

de

38-40°C.

Se

lasă

să

se

răcească

la aproximativ 20°c.

Se adaugă 2,5 ml de soluție Carrez I (3.2) și se agită timp de 30 de secunde, apoi se adaugă

2,5ml de soluție Carrez

li

(3.3)

și

se

agită

din

nou,

timp

de

30

de

secunde.

Se completează până la 100ml cu apă, se omogenizeaza și se filtrează. Utilizând o pipetă, se reține o cantitate de filtrat ce nu depășește

25ml și care conține de preferință 40-80mg

de lactoză și aceasta se transferă într-un pahar Erlenmeyer de 300ml. Dacă este necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă.

Se efectuează în același mod un test martor cu 5ml de suspensie de drojdie. (3.1).

Se determină continutul în lactoză în conformitate cu metoda Luff-Schoorl, du '

pă cum urmează: se adaugă exact

25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) și două granule de piatră ponce

(3.5).

Se

agită

mecanic,

în

timp

ce

se

încălzește deasupra unei flăcări libere, la înălțime medie și se aduce lichidul la fierbere în aproximativ două minute. Se plasează paharul

Erlenmayer

pe o sita de azbest

cu o gaură de aproximativ 6cm în diametru sub care a fost aprinsă flacăra. Flacăra trebuie să fie reglată în așa fel incat numai baza Erlenmeyer-ului să fie încălzită. Se ataseaza un refrigerent de reflux la paharul Erlenmeyer. Se

fierbe timp de 1 O

minute. Se răcește imediat în apă rece și după aproximativ 5 minute se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10ml de soluție de iodură de potasiu (3.6) și imediat după aceea (cu grijă, datorită riscului de spumare abundentă) se adaugă 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7). Se titrează cu soluție de tiosulfat de sodiu

O , 1N (3.8) până când apare o culoare galbuie, se adaugă

solutie

de amidon ca indicator (3.9) și se continua titrarea pana la atingerea virajului.

Se efectuează aceeași titrare pe un amestec măsurat cu acuratețe de 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) și 25ml de apă,

după care se adaugă 10ml de iodură de potasiu (3.6) și 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7) fără fierbere.

6.

Calcularea rezultatelor

Utilizându-se tabelul atașat, se stabilește cantitatea de lactoză, în mg ce corespunde diferenței dintre rezultatele celor două titrări, exprimată în ml de tiosulfat

O, 1N.

Se

exprimă

rezultatul

(ca

parti

de

lactoza

anhidra) procentual..

7.

Observatie

Pentru '

produse

ce conțin

mai mult

de 40°/o

zahăr

fermentabil, se utilizează mai mult de 5ml de suspensie de drojdie (3.1).

1O. Determinarea potasiului

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine nivelul de potasiu din furaje.

2.

Principiu

Proba este calcinată iar cenușa dizolvată în acid clorhidric. Conținutul în sodiu al soluției este determinat prin fotometrie cu flacără, în prezența clorurii de cesiu și a azotatului de aluminiu. Adăugarea

acestor

substanțe

elimină

în

mare

măsură interferența elementelor perturbatoare.

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml.

3.2.

Clorură de cesiu p.a

3.3.

Azotat de aluminiu Al (NO3)3 x9 H2O, reactiv cu scop general.

3.4.

Clorură de potasiu p.a. , anhidra.

3.5.

Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) și 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3), se completează

până la un litru cu apă și se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic.

3.6.

Soluție standard de potasiu: se dizolvă 1,907g de clorură de potasiu în apă (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1),

se

completează

până

la

un

litru

cu

apă

și

se omogenizează.

Se depozitează

în sticle de plastic. 1ml al acestei soluții conține 1,00mg de potasiu.

4.

Aparatură

4.1.

Creuzete din platină, siliciu sau porțelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace.

4.2.

Cuptor electric cu termostat.

4.3.

Flamfotometru

5.

Procedură

5.1.

Analiza probei

Ca regulă generală, se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximație

de

10mg,

se

plasează

într-un

creuzet

și

se calcinează la 450°C, timp de trei ore. După răcire se transferă cantitatea de cenușă într-un balon gradat de 500ml, utilizându­ se 250-300ml de apă și se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când

a încetat

eliberarea

de dioxid de carbon, se încălzește soluția și se menține temperatura la aproximativ go 0 c, timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la

temperatura camerei, se completează până la semnul cu apă, se omogenizeaza și se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtratul ce conține maxim 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5),

se

completează

până

la

semnul

cu

apă

și

se omogenizează. În cazul unor cantități de potasiu mai mari, se diluează soluția ce trebuie analizată în proporții potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare.

Tabelul de mai jos e dat ca un ghid pentru o probă de

aproximativ 1Og.

Continut presupus

de potasiu din proba(% K)

Factor de dilutie

Parte alicota in ml

pana la 0,1

-

50

0.1 pana la 0.5

-

10

0.5 pana la 1.0

-

5

1.0 pana la 5.0

1:1O

10

5.0 pana la 1O.O

1:10

5

1O.O pana la 20.0

1:20

5

Se măsoară prin fotometrie cu flacără la

o lungime de undă de 768nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare.

5.2.

Curbă de calibrare

Se plasează exact 10ml

de soluție standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă și se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1O,15, 20 și 25ml din această soluție, corespunzând respectiv la

cantitățile de potasiu de 0,2,

0,4,

0,6, O, 8 și 1,0mg/ml. Se completează seriile cu baloane martor ce nu conține

soluție

standard.

Se adaugă

1O ml de agent

de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă și se omogenizează. Se efectuează măsurătorile, așa cum s-a indicat la 5.1. Curba de calibrare este în general aliniată la concentrația de potasiu de 1mg la 100ml de soluție.

6.

Calcularea rezultatelor

Se exprimă rezultatul ca procent din probă.

7.

Observatii

Nu es ' te întotdeauna necesar să se adauge

agentul de

încărcare

(3.5) pentru

a se elimina interferența elementelor perturbatoare.

11. Determinarea sodiului

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil2i determinarea nivelului de sodiu din furaje.

2.

Principiu

Proba

este

calcinată

iar

cenușa

dizolvată

în

acid clorhidric. Conținutul în sodiu al soluției este determinat prin fotometrie

cu flacără,

în prezența

clorurii

de cesiu

și a azotatului de aluminiu. Aditia acestor substante elimină în mare

măsură interferența elemen ' telor perturbatoare. '

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml.

3.2.

Clorură de cesiu p.a

3.3.

Azotat de aluminiu Al

(N0

3 )3 x9

H20,

reactiv cu scop general.

3.4.

Clorură de potasiu p.a. , anhidra.

3.5.

Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) și 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3),

se completează

până la un litru cu apă și se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic.

3.6.

Soluție standard de sodiu: se dizolvă în apă 2,542g de clorură de sodiu (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1), se completează până la un litru cu apă și se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 1ml din aceste soluții conține 1,00mg de sodiu.

4.

Aparatură

4.1.

Creuzete din platină, siliciu sau porțelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace.

4.2.

Cuptor electric cu termostat.

4.3.

Flamfotometru

5.

Procedură

5.1.

Analiza probei

Ca regulă generală se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximație de 10mg, se plasează într-un creuzet (4.2) și se calcinează

la

450°C

timp

de

trei

ore.

Se

evită supraîncălzirea(aprinderea). După răcire se transferă cantitatea de cenușă

într-un balon gradat de 500ml, utilizându-se 250- 300ml de apă și se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când

a

încetat

toată

eliberarea

de

dioxid

de carbon,

se încălzește soluția și se menține temperatura

la aproximativ 90°C timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la temperatura camerei, se completează până la semn cu apă, se omogenizeaza și se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtrat ce conține un maxim de 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5),

se

completează

până

la

semn

cu

apă

și

se omogenizează.

În cazul unor niveluri de sodiu mai mari se diluează soluția ce trebuie analizată în proporții potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare.

Tabelul de mai jos e redat ca ghid pentru o probă de aproximativ 1 Og.

Continut presupus de sodiu din probă

(%

Na)

Factor de dilut , ie

Parte alicota,tn ml

pana la 0.1

-

50

0.1 până la 0.5

-

10

0.5 până la 1.0

-

5

1.0 până la 5.0

1:10

10

5.0 până la 1O.O

1:10

5

1O.O până la 20.0

1:20

5

Se măsoară intensitatea radiatiei emise la o lungime de undă de 589nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare.

5.2.

Curbă de calibrare

Se plasează exact 10ml de soluție standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă

și se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1 O, 15,20 și 25ml din această soluție, corespunzând respectiv la

cantități de sodiu de 0,2,

0,4,

0,6,

O,

8 și 1,0mg/ml. Se completează seriile cu balene martor ce nu conțin soluție standard. Se adaugă 1 O

ml de agent de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă

și se omogenizează. Se efectuează măsurători, așa cum s-a indicat la

5.1.

Curba

de

calibrare

este

în

general

aliniată

la concentrația de sodiu de 1mg la 100ml de soluție.

6.

Calcularea rezultatelor

Se exprimă rezultatul ca procent din probă.

7.

Observatii

7.1.

Pe '

ntru produse ce conțin mai mult de 4% sodiu este

preferabil să se calcineze substanța timp de două ore într-un creuzet cu capac. După răcire se adaugă apă, se aduce apa în suspensie prin intermediul unui fir de platină, se usucă și se calcinează din nou, timp de două ore, într-un creuzet cu capac.

7.2.

Dacă proba constă numai din substanțe minerale, se dizolvă fără o calcinare prealabilă.

12. Determinarea zahărului

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil să se determine cantitatea de zaharuri reduse și toate zaharurile după inversie, exprimată ca glucoză sau când este cazul ca sucroză, convertită de factorul 0,95. Această metodă este aplicabilă furajelor combinate. Sunt prevăzute

metode

speciale

pentru

alte

furaje.

Când

este necesar, trebuie să fie măsurată separat lactoza

și trebuie să se tină cont de aceasta atunci când se calculează rezultatele.

2.

P '

rincipiul

Extractia

zaharurilor

dintr-o

probă

cu

un amestec.Clarificarea solutiei obtinute cu solutiile Carrez I si li.Separarea etanolului si determinarea zaharurilor cu reactiv Luff-Schoorl înainte si dupa invertire .

3.

Reactivi

3.1.

Etanol

40%

(v/v)

d 20

=0,948g/ml

neutralizat

m

prezenta de fenolftaleină:

3.2.

Soluție Carrez I: se dizolvă 21,9g de acetat de zinc Zn(CH 3 COO) 2 .2H2O și 3g de acid acetic glacial în apă. Se completează până la 100ml cu apă.

3.3.

Soluție Carrez

li:

se dizolvă 10,6g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN6), 3H2O în apă. Se completează până la 100ml cu apă.

3.4.

Soluție O,1% (w/v) de metil oranj.

3.5.

Acid clorhidric 4n.

3.6.

Acid clorhidric O,1n.

3.7.

Solutie de hidroxid de sodiu O,1n.

3.8.

Reac ' tiv Luff-Schoorl

3.8.1

Soluție de cupru: se dizolvă 25g de sulfat de cupru

p.a CuSO4x 5H2O (fara) fier, în 100ml de apă.

3.8.2

Soluție de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric A.R., C6HaO7xH2O în 50ml de apă.

3.8.3

Soluție de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8g de

carbonat de sodiu anhidru p . a. în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă sa se raceasca.

Amestecand cu atentie, se pune soluția de acid citric (3.8.2) peste soluția de carbonat de sodiu (3.8.3). Se adaugă soluția de sulfat de cupru (3.8.1) și se completează până la un litru cu apă. Se lasă in repaus peste noapte și apoi se filtrează. Se

verifica

normalitatea

reactivului

astfel

obținut

(Cu O,1 N;Na2CO 3

2N). PH-ul soluției trebuie să fie de aproximativ 9,4.Se lasa sa se raceasca.

3.9.

Soluție de tiosulfat de sodiu O,1n.

3 . 1O .

Soluție de amidon:

Sg de amidon solubil dizolvat în 30ml de apă se fierb intr-un litru de apa, trei minute, se lasă să se răcească și dacă e necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ.

3.11.

Acid sulfuric 6N.

3.12.

Soluție 30% (w/v) de iodură de potasiu.

3.13.

Piatră ponce granulată, fiartă în acid clorhidric, spălată în apă și uscată.

3.14.

3-metilbutan-1-ol.

4.

Aparatură

Mixer(agitator) cu f ecvență rotatorie de 35-40 rpm.

5.

Procedură

5.1.

Extracția probei

Se cântăresc 2,5g din probă cu o aproximație de 1mg și se introduc într-un balon cotat de 250ml. Se adaugă 200ml de etanol (3.1) și se agita mecanic

timp de o oră. Se adaugă 5ml de soluție Carrez I (3.2) și se agită timp de un minut apoi se mai adaugă 5ml de soluție Carrez li (3.3) agitand din nou, timp de 1 minut.

Se

completează

la

volum

cu

etanol

(3.1),

se omogenizează și se filtrează.

Se rețin 200ml din filtrat și se evaporă la aproximativ jumătate din volum, pentru a se elimina majoritatea

etanolului.

Se

transferă

întreaga

cantitate

din reziduul de evaporare într-un balon cotat de 200ml, utilizându­ se apă fierbinte, se răcește, se aduce la volum cu apă, se omogenizează

și se filtrează,

dacă este necesar.

Această soluție va fi utilizată pentru

a se determina cantitatea de zaharuri reduse și după invertire, a zaharului total.

5.2.

Determinarea zaharurilor reducatoare

Utilizându-se o pipetă, se ia o cota parte din filtrat(5.1) sa nu depaseasca 25ml de soluție si care sa nu conțin mai puțin de 60mg de zaharuri reduse, exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată și se determină conținutul de zaharuri reduse

prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent al glucozei din probă.

5.3.

Determinarea zaharurilor totale după invertire

Utilizându-se

o pipetă,

se iau

50ml de soluție

și se transferă

într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă câteva picături de soluție de metil oranj (3.4) apoi, cu grijă și agitând continuu, se adaugă acid clorhidric 4N (3.5), până când lichidul virează spre un roșu accentuat. Se adaugă 15ml de acid clorhidric O,1 N (3.6), se imersează rapid balonul într-o baie de apă la fierbere și se ține acolo timp de 30 de minute. Se răcește rapid la aproximativ 20°c și se adaugă 15ml de soluție de hidroxid de sodiu O,1n. Se completează apoi până la 100ml cu apă și se omogenizează. Se rețin cel mult 25ml ce conțin mai puțin de 60mg de zaharuri reduse exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată și se determină conținutul de zaharuri

reduse prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent de glucoză sau, unde e cazul, sucroză, multiplicându­ se cu factorul 0,95.

5.4.

Titrare prin metoda Luff-Schoorl

Utilizându-se o pipetă, se iau 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) și se transferă într-un pahar Erlenmeyer de 300ml.Se adaugă 25ml de soluția clarificată de zahăr. Se adaugă 2 granule de piatră ponce (3.13), se încălzește, se agită manual deasupra unei flăcări libere la înălțime medie și se aduce lichidul la fierbere în aproximativ două minute. Se instaleaza imediat balonul Erlenmeyer pe o sita azbest, cu o gaură de aproximativ 6cm în diametru, sub care a fost aprinsă o flacără. Flacăra

va fi reglată

în așa fel ca numai baza balonului Erlenmeyer să fie încălzită. Se atașează un refrigerent de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de exact 1O minute. Se răcește imediat în apă rece iar după aproximativ cinci minute se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10ml de soluție iodată de potasiu (3.12) și imediat după aceea (cu grijă, datorită riscului de spumare abundentă), se adaugă 25ml de acid sulfuric 6n (3.11). Se titrează cu o soluție de tiosulfat de sodiu O,1n (3.9) până când apare o culoare galbuie, se adaugă solutie de amidon (3.1O) și se finalizează titrareapana la atingerea virajului.

Se efectuează aceeași titrare pe un amestec măsurat cu acuratețe de 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) și 25ml de apă, după ce se adaugă 10ml de soluție de iodură de potasiu (3.12) și 25ml de acid sulfuric 6n (3.11), fără fierbere si se titrează identic

6.

Calcularea rezultatelor

Utilizând tabelul de mai Jos se stabilește cantitatea de glucoză în mg ce corespunde diferenței dintre valorile celor două titrări,

exprimată

în mg de tiosulfat

de sodiu

O,1n; rezultatele se exprima procentuală

7.

Proceduri speciale

7.1.

În cazul furajelor ce sunt bogate în melasă și alte furaje ce nu sunt în particular omogene, se cântăresc 20g și se trec cu 500ml de apă într-un balon cotat de un litru. Se agita timp de o oră apoi se clarifică utilizând reactivii Carrez I (3.2) și

li (3.3), așa cum s-a descris la punctul 5.1. utilizându-se totuși, de data aceasta, de patru ori cantitățile din fiecare reactiv. Se aduce la volum cu etanol 80% (v/v).Se omogenizează și se filtrează. Se elimină etanolul, așa cum s-a descris la punctul

5.1. Dacă nu există amidon dextrinizat,

se aduce la volum cu apă distilată.

7.2.

În cazul melasei și al subproduselor ce sunt bogate în zahăr și aproape libere de amidon (roșcove, brichete de sfeclă etc.), se cântăresc 5g, se trec într-un balon cotat de 250ml, se adaugă 200ml de apă distilată și se agita timp de o oră sau mai mult, dacă e necesar. Se clarifică utilizând reactivii Carrez I (3.2) și li (3.3) așa cum s-a descris la punctul 5.1. Se aduce la volum cu apă rece,

se omogenizează

și se filtrează.

Se continuă așa cum s-a descris la punctul 5.3., pentru a se determina cantitatea de zaharuri totale.

8.

Observatii

8.1.

Pe '

ntru a se preveni spumarea este recomandabil să

se

adauge

(indiferent

de

volum)

aproximativ

1ml

de

3- metilbutan-I-ol (3.14) înainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl.

8.2.

Diferența

dintre

conținutul

total

de

zahar

după invertire,

exprimat

ca

glucoză

și

conținutul

de

zaharuri reducatoare,

exprimat ca glucoză, multiplicat cu 0,95, redă conținutul procentual de sucroză.

8.3.

Pentru

a

se

determina

continutul

de

zaharuri reducatoare, excluzând lactoza, două metod '

e pot fi adoptate:

8.3.1.

Pentru o calculare aproximativă, se multiplică cu 0,675 conținutul de lactoză stabilit printr-o oarecare metodă de analiză și se scade rezultatul obținut din conținutul zaharurilor reducatoare

8.3.2.

Pentru o calculare precisă a zaharurilor reducatoare,

excluzând lactoza, aceeași probă trebuie să fie utilizată pentru cele două determinări finale. Una din analize este efectuată pe o parte din soluția obținută la punctul 5.1., cealaltă pe partea soluției

obținute

în timpul determinării

lactozei

de metoda stabilită pentru acel scop (după fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri și clarificare).

În

ambele

cazuri

cantitatea

de

zahăr

prezentă

este determinată prin metoda Luff-Schoorl și calculată în mg de

glucoză. Una din valori este scăzută din cealaltă, iar diferența este exprimată procentual.

Exemplu:

Cele două volume preluate corespund, pentru fiecare determinare, la o probă de 250mg.

În primul caz sunt consumați 17ml de soluție de tiosulfat

de sodiu O,1N, corespunzând la 44,2mg de glucoză.

În al doilea caz sunt consumați 11ml, corespunzând la 27,6mg de glucoză.

Diferența este de 16,6mg de glucoză.

Conținutul de zahar reducator (excluzând lactoza), calculat ca glucoză, este:

4x16,6

= 6,64%

10

Tabel de valori pentru 25ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2S20 3

O,1N, 2 minute de încălzire, 1O minute de fierbere

Na2 S2 Os Glucoză, fructoză

zahar invertit

0,1N

ml

mg

C5H1206

diferentă

mg

diferență

mg

diferent , ă

0,1N

ml

1

2.4

2.4

'

3.6

3.7

3.9

3.9

1

2

4.8

2.4

7.3

3.7

7.8

3.9

2

3

7.2

2.5

11.0

3.7

11.7

3.9

3

4

9.7

2.5

14.7

3.7

15.6

4.0

4

5

12.2

2.5

18.4

3.7

19.6

3.9

5

6

14.7

2.5

22.1

3.7

23.5

4.0

6

7

17.2

2.6

25.8

3.7

27.5

4.0

7

8

19.8

2.6

29.5

3.7

31.5

4.0

8

9

22.4

2.6

33.2

3.8

35.5

4.0

9

10

25.0

2.6

37.0

3.8

39.5

4.0

10

11

27.6

2.7

40.8

3.8

43.5

4.0

11

12

30.3

2.7

44.6

3.8

47.5

4.1

12

13

33.0

2.7

48.4

3.8

51.6

4.1

13

14

35.7

2.8

52.2

3.8

55.7

4.1

14

15

38.5

2.8

56.1

3.9

59.8

4.1

15

16

41.3

2.9

59.9

3.9

63.9

4.1

16

17

44.2

2.9

63.8

3.9

68.0

4.2

17

18

47.1

2.9

67.7

4.0

72.2

4.3

18

19

50.0

3.0

7.1.7

4.0

76.5

4.4

19

20

53.0

3.0

75.7

4.1

80.9

4.5

20

21

56.0

3.1

79.8

4.1

85.4

4.6

21

22

59.1

3.1

83.9

4.1

9Q.O

4.6

22

23

62.2

88.0

94.6

23

14.

Determinarea ureei

1.

Scop și domeniu de aplicare

Această metodă face posibil determinarea nivelului de uree din furaje.

2.

Principiu

Proba

este

suspendată

în

apă

cu

un

agent

de

de clarificare.

Suspensia

este

filtrată.

Conținutul

de

uree

al filtratului

este

determinat

după

adăugarea

a

4- dimetilaminobenzaldehidă

(4-DMAB),

măsurând

densitatea optică la o lungime de undă de 420nm.

3.

Reactivi

3.1. Solutie de 4-dimetilaminobenzaldehidă: de dizolvă 1,6g de 4-DMA '

B p.a. în 100ml de etanol 96°/o și se adaugă

10ml de acid clorhidric p.a.. (d 20 =1,19g/ml). Acest reactiv poate fi folosit pentru o perioadă de maximum două săptămâni.

3.2. Soluție Carrez I: se dizolvă 21,9g de acetat de zinc, Zn (CH 3 C00) 2 x 2H20 și 3g de acid acetic glacial în apă. Se completează până la 100ml cu apă.

3.3. Soluție Carrez li: se dizolvă 10,6g de ferocianură de potasiu în apă, K4Fe(CN) 6

,

3H20. Se completează până la 100ml cu apă.

3.4. Carbune activ p.a. ce nu absoarbe uree (ce trebuie controlată).

3.1.

Soluție O,1%(w/v) de uree p.a.

4.

Aparatură

4.1.

Mixer (agitator) cu frecventa rotatorie de aproximativ 35-4Orpm.

4.2.

Eprubete: 16Ox 16mm cu dop rodat de sticlă.

4.3.

Spectrofotometru.

5.

Procedură

5.1.

Analiza probei

Se cântăresc 2g de probă cu o aproximație de 1mg și se introduc cu 1g carbune activ (3.4) într-un ·balon cotat de 500ml. Se adaugă 400ml de apă și 5ml de soluții Carrez I (3.2) și

11

(3.3). Amestecul se agita timp de 30 de minute cu ajutorul agitatorului rotativ. Se completează la semn cu apă, se agită și se filtrează.

Din filtratul clar si incolor se iau 5ml si se introduc înt-o eprubeta cu dop slefuit. Se adaugă 5ml de soluție 4-DMAB (3.1) și se omogenizeaza. Se pregateste in paralel o solutie martor, procedand conform pct. 5.1 Se introduc eprubetele cu solutia de analizat si respectiv cu solutia martor într-o baie de apă

si se mentin 15 minute

la 20°c.

Apoi se măsoară extinctia solutiei de analizat in raport cu solutia martor, la lungimea de unda de 420nm. Se citeste pe curba de etalonare continutul de uree corespunzator extinctiei masurate.

5.2.

Curba de calibrare

Se rețin volume a 1,2,4,5 și 10ml de soluție de uree (3.5), se introduc în baloane cotate de 100ml și se completează la semn cu apă. Se iau cate 5ml din fiecare balon, in eprubete cu dop slefuit. Se adaugă cate 5ml de soluție 4-DMAB (3.1) în fiecare din acestea si se omogenizeaza.Se introduc eprubetele într-o baie de apa si se mentin timp de 15minute la 20°c .Se masoara

extinctia

acestor

solutii

la lungimea

de unda de 420nm, in raport cu o soluție martor constituita din 5ml de 4- dmab și 5ml de apă liberă de uree. Se traseaza curba de etalonare.

6.

Calcularea rezultatelor

Se determină cantitatea de uree din probă, utilizându-se curba de calibrare.

Se exprimă rezultatul precentual.

7.

Observa - tii

7.1.

ln '

cazul cantităților de uree ce depășesc 3%, se

reduce proba la 1g sau se diluează soluția inițială, astfel încât să nu existe mai mult de 50 de mg de uree în 500ml.

7.2.

în cazul cantităților scăzute de uree, se mărește

proba atât timp cât filtratul rămâne clar si incolor..

7.3.

Dacă proba conține compuși azotați simpli, precum aminoacizi, densitatea optică trebuie să fie măsurată la 435nm.

15.

Estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia

1.

Scop și domeniu de ap l icare

Acest test face posibilă estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia și arată dacă aceste produse au fost preparate suficient de mult timp.

2.

Principiu

Activitatea ureazică este estin,ată prin cantitatea de azot amoniacal eliberată de 'Ig de produs per minut, la 30°C.

3.

Reactivi

3.1.

Acid clorhidric O,1N.

3.2.

Solutie de hidroxid de sodiu O,1n.

3.3.

Solu ' tie tampon de fosfati: se dizolva 4,45g fosfat

disodic(Na2HPO4x2H2O) si 3,40g fosfat monopotasic(KH2PO4 x 2H2O) in apa; s:e completeaza cu apa la 1000ml.

3.4.

Uree

,solutie

cu pH 6,9-7,0: se dizolva 30g uree in 1000ml solutie tampon de fosfati.

4.

Aparatură

4.1.

Aparat ele titrare potențiometrică sau pH-metru

de înaltă sensibilitate (pH 0,02) cu agitator magnetic.

4.2.

Baie de apă echipată cu termostat stabilit la exact 30°c.

4.3.

Eprubete de 150x18mrn

cu

dop slefuit.

4.4.

Sita cu dimens i unea ochiurilor de 0,2mm

4.5.

Moara de laborator,usor de curatat si care permite macinarea fara a provoca

i ncalzirea produsului

5.

Procedură

Se mărunț : esc aproximativ 10g de probă (de exemplu într­ o râșniț:ă de cafea), astfel ca aceasta să treacă printr-o sită cu ochiuri de 0,2rnm. Se cântăresc 0 , 2g din proba mărunțită cu o aproximație de 1mg, se introduc într-o E prubetă cu dop rodat de sticlă și se adau lă 1 On1I

de solutie de uree (3.4). Se astupa imediat și se agit i cu vigoare. Se introduce eprubeta într-o baie de apă fixată exact la 30°C și se agitii cu vigoare. Se adaugă imediat 10ml de acid clorhidric (3.1), se răcește rapid la 20°c și

se transvazeaza cantitativ conținutul eprubetei într-un vas de titrare, clătindu-se de două ori cu 5ml de· apă. Utilizându-se un electrod de sticlă (4.1), se titrează imediat și rapid la pH 4,7 cu soluție de hidroxid de sodiu

O, 1N .

Se efectuează

o determinare martor după cum urmează: se introduce repede o probă de 0,2g cântărită cu o aproximație de 1mg într-o eprubetă cu dop rodat de sticlă, se adaugă 10ml de acid clorhidric

O, 1n (3.1) și apoi 10ml

solutie de uree (3.4). Se răcește eprubeta imediat în apă cu gheață și se lasă acolo timp de 30 de minute. Se aduce apoi la temperatura de 20°c se transfera cantitativ conținutul eprubetei în paharul in care se face titrarea.Se titreaza imediat si repede cu hidroxid de sodiu solutie

O, 1 npana la pH 4,7 .

6.

Calcul:

Activitatea ureazica se calculeaza cu formula:

1,4

X

(a-b)

[ mg N/gxmin la 30 °c ]

30x E

unde

a = volumul solutiei de hidroxid de sodiu

O, 1n folosit la titrarea probei de analizat, in ml

b = volumul solutiei de hidroxid de sodiu

O, 1n folosit la titrare la determinarea martorului, in ml

1,4 = cantitatea de azot corespunzatoare la 1ml, hidroxid de sodiu

O, 1 n

30 durata tratarii probei cu solutie de uree,in minute

7.

Observatii:

7.1.

Aceasta

metoda

este

aplicabila

pentru

activitate ureazica peste 1 mg de N/g/min. la 30 °C.Pentru produse cu acivitate ureazica mai mare , cantitatea de proba poate fi redusa la 50mg.

7.2.

Produsele cu continut de grasime mai mare de 10% trebuie in prealabil degresate.

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 153.453 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Articolul 3

— Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 19.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 19/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în avoparcină și monenzin de sodiu

ANEXĂ

la norma veterinară

apă.

Extract de drojdie de bere·.3,0 g Extract de carne 1.5 g Glucoză:1,0 g

Agar 15,0 g

Apă 1000 ml

pH:6,5 (după sterilizare).

4.2.

Etanol 20% (v/v): se diluează 200 ml etanol cu 800 ml

4.3.

Acid clorhidric, d: 1,18 - 1,19.

4.4.

Hidroxid de sodiu, solutie 2 M

4.5.

Tampon fosfat,

O, 1

M:

_

'

Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH2 04: 13,6 gă Apă până la 1 OOO

ml.

Se aduce pH-ul la 4.5.

4.6.

Amestec

de

acetonă/apă/acid

clorhidric

(4.3):

65/32.5/2.5 (v/v/v).

4.7.

Substanță

standard:

avoparcină

de

activitate cunoscută.

5.

Solut , ii etalon

Se dizolvă o cantitate precis cântărită de

1O

mg din

°

substanța standard (1-7) în tampon fosfat (4.5) și se diluează cu acest tampon pentru a se obține soluția stoc ce conține 100 µg avoparicină/ml. Se păstrează în flacoane închise la 4

C, această soluție este stabilă timp de maxim șapte zile.

5.1.

Pentru premixuri

Din această soluție stoc se prepară prin diluție succesivă cu ajutorul tamponului, (4.5) următoarele soluții :

Sa

4.0 µg/ml

S4

2.0 µg/ml

S2

1.0 µg/ml

S1

0.5 µg/ml

5.2.

Pentru furaje

Din soluția stoc se prepară prin dilutie succesivă cu ajutorul tamponului, (4.5) următoarele soluții

Sa

2.0 µg/ml

S4

1.0 µg/ml

S2

0.5 µg/ml

S1

0.25 µg/ml

6.

Prepararea soluțiilor de extract și de probă

6.1.

Premixuri

Se

cântărește

cu

o

precizie

de

1O

mg,

o

cantitate suficientă de probă ce conține 10,0 până la100 mg avoparcină. Se transferă într-un balon cotat de 100 ml cu 60 ml amestec (4.6) și se agită timp de 15 minute pe agitatorul mecanic Se controlează pH-ul și se aduce la pH 2 cu acid clorhidric, dacă este necesar (4.3). Se aduce la volum cu amestecul (4.6) și se omogenizează.

O parte se filtrează printr-o hârtie de filtru potrivită (ex. Whatman nr. 1), se elimină primii 5 ml de filtrat. Se ia o parte alicotă și se aduce pH-ul la 5.4 cu soluție de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează această soluție cu tampon (4.5) pentru a se obține o concentrație dorită de avoparicină de 4.0 µg/ml ( = U 8

)

Pentru această soluție se prepară soluțiile U 4

(conținut evaluat: 2.0 µg/ml), U2 (conținut evaluat: 1.0 µg/ml) și U 1

(conținut evaluat: 0.5 µg/ml) prin diluție succesivă (1+1) cu tampon (4.5).

6.2.

Furaje

Se cântărește o cantitate de probă de 50 g și se agită 100 ml din amestec (4.6) timp de 30 minute pe agitatorul mecanic. Se

clarifică

extractul

prin

centrifugare

(utilizând

tuburi

de centrifugă acoperite cu dopuri), se ia o parte alicotă de extract clarificat (vezi tabelul de mai jos) și se aduce pH-ul la 4.5 ,

fU

soluție de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează această parte alicotă cu tampon (4.5) pentru a se obține U 8

(vezi tabelul de mai jos)

Pentru această soluție se prepară soluțiile U 4

(conținut evaluat: 1 µg/ml), U2 (conținut evaluat: 0.5 µg/ml) și U 1

(conținut evaluat: 0.25 µg/ml) prin diluție succesivă (1+1) cu tampon (4.5).

Nivel presupus de avoparcină (mg/kg)

5

7.5

10

15

20

40

Masa probei (g

+

0.1

g)

50

50

50

50

50

50

Volumul amestecului (4.6) (ml)

100

100

100

100

100

100

Volumul extractului clarificat (ml)

20

15

20

15

20

10

Volum final (ml):

Ua

25

25

50

50

100

100

Concentratia dorită

Ua

µg/ml

'

2

aprox.2

2

aprox.2

2

2

7.

Procedura de testare

7.1.

Însământarea mediului de testare

Se însămânțe '

ază mediul de testare (4.1) cu suspensie de spori (3.2) la 50 - 60

°c.

Prin experimente preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.1) se determină cantitatea de suspensie

de spori necesară pentru a se determina cele mai întinse și mai clare zone de inhibiție cu diferite concentrații de avoparcină.

7.2.

Prepararea plăcilor de însămânțare

Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizâdu-se patru concentrații din soluția etalon (S 8

S 4

S 2

S 1

)

și patru concentrații din soluția probei

(Ua,

U4,U2, U 1 ). Aceste patru concentrații ale extractului și ale etalonului trebuie, în mod necesar, să fie

plasate în fiecare placă. în acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a se permite să fie realizate în mediu de agar cel puțin opt godeuri cu un diametru de 1O până la 13 mm și la nu mai puțin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe plăci formate dintr-o placă de sticlă cu o față din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru și 20 mm înăltime.

'

Se toarnă în plăci o cantitate din mediul (4.1) însămânțat

cum este indicat la punctul 7.1., pentru a se obține un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri și se pun în acestea volume de probă exact măsurate și soluții standard (între O,1O și O,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentrație de cel puțin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.

7 '

.3. lncubatie

Se incubea ă plăcile timp de 16 - 18 ore, la 30

° C.

8.

Evaluare

a)

SL=

1s

1

+4s 2

+S

4

-2S 8

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:

(b)

SH =

7Sa +4S4 +S2 -2S1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U1,U4 și Ua cu S1, S2 și S 8

din formula mentionată mai sus.

Se

înregist ' rează

valorile

calculate

ale SL

și SH, pe aceeași hârtie grafică și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluția etalon. Se înregistrează în mod similar UL și UH și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În

absenta

oricărei

interferente

liniile

trebuie

să

fie paralele.

Pentr ' u

scopuri

practice

l ' iniile

pot

fi

considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie U1 și S 1

fie U 8

și S 8

pot fi eliminate și SL, SH, UL și UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite".

(a')

SL

=

5S

1

+ 2S2-2S

4

sau

5S

2

+ 2S4-S

g

6

6

(b')

ss

=

ss

4

+2s

2

-s 1

sau

5S 8

+2s4-s

2

6

6

și în mod similar pentru UL și UH. Trebuie să fie respectate aceleași criterii de paralelism. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activității relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule:

Pentru patru nivele

(c)

LogA

=

(Ul

+U

2

+U

4

+U

g

-Sl -S

2

-S

4

-S

g

)

X

0,602

U 4

+U

g +S 4 +S g -U l

-U

2

-Sl -S 2

Pentru patru nivele

(d)

LogA=

(Ul

+U2 +U

4

-s

l

-S-S24)

X

0,401

U

4

+S 4

-Ul , -Sl

sau

(d')

LogA=

(U 2

+U 4

+U

8

-S

2

-S

4

-S

8

)X0,401

U 8 +S 8 -U 2 -S 2

Activitate reală - activitate presupusă x activitate relativă Dacă activitatea relativă este în afara gamei de valori

cuprinse între 0,5 și 2,0, atunci se repetă proba făcând ajustări corespunzătore ale concentrațiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale soluțiilor etalon. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat

obținut trebuie să fie considerat

ca aproximativ

și acesta trebuie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea .

Dacă paralelismul nu este totuși realizat,

înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

9.

Repetabilitate

'

Diferența între rezultatele celor două determinări paralele, efectuate pe aceleași probă prin aceeași analiză, nu trebuie să depășească

-

2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de avoparcină până la 1O mg/kg,

-

20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 1O până la 25 mg/kg,

-

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg,

-

10% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.

2. Determinarea monenzinului de sodiu prin difuzie in mediu de agar

1.

Scop și aplicabilitate

Această metodă are ca scop determinarea monenzinului de sodiu din furaje și premixuri. Limita minimă a determinării este de 1O mg/kg (1O ppm).(3)

2.

Principiu

Proba este extrasă cu 90°/c> metanol. Extractul este supus procedurilor corespunzătoare conform cu conținutul probei în monenzin de sodiu. Activitatea antibiotică a acestuia este determinată prin măsurarea difuziei monenzinului de sodiu într­ un mediu de agar însămânțat cu Bacillus subtilis. Difuzia este

relevată prin formarea zonelor de inhibiție a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporțional cu

logaritmul

concentrației

de

antibiotic

peste

gama concentratiilor

de

antibiotic

utilizate.

Sensibilitatea

acestui

sistem de

' testare este redusă în prezența sodiului.

3.

Microorganism: Bacillus subtilis attc 6633 (ncib 8054)

3.1.

întretinerea culturii stoc

Se însăm '

ântează mediul de cultură în tuburi înclinate

(4.1), cu Bacillus ubtilis și se incubează peste noapte la 30

° C. Cultura se păstrează la frigider la 4

°

C. Se reînsămânțează

lunar.

3.2.

Prepararea suspensiei de spori

C)

°

°

Se recoltează o cultură crescută pe agar înclinat preparat recent, (3.1) cu 2-3 ml apă sterilă. Această suspensie se utilizează la însămânțarea a 300 ml mediu de cultură (4.1) conținut într-un flacon tip Roux și se incubează timp de 3 - 5 zile la 30

C. Cultura se recoltează în 15 ml etanol 20% (4.3), după ce

se

controlează

sporularea

la

microscop

.și

se omogenizează. Această suspensie poate fi menținută timp de cel puțin 5 luni, la aproximativ la 4

C.

4.

Mediu de cultură și reactivi

4.1.

Mediu de cultură

(2)

Triptona

10,0 g

Extract de drojdie de bere Extract de carne

1.5 g

3,0 g

Glucoză

1,0 g

Agar (conform cu calitatea)

10,0 - 20,0 g Apă

1000 ml

pH 6,5(după sterilizare).

4.2.

Mediul probei

Glucoză

Extract de drojdie de bere

Fosfat hidrogenat de potasiu, K2HPO4 Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH2 PO4

10,0 g

2,5 g

0,69g

0,45 g

Agar (conform cu calitatea)

Apă

pH 6 (după sterilizare).

10,0 - 20,0 g

1000 ml

apă.

4.3.

Etanol 20% (v/v): se diluează 200 ml etanol cu 800 ml

4.4.

Metanol anhidru

4.5.

Metanol 90% (v/v): se diluează 900 ml metanol (4.4)

cu 100 ml apă

4.6.

Metanol 50% (v/v): se diluează 500 ml metanol (4.4) cu 500 ml apă

4.7.

Oxid de aluminiu granulat (Aicea F, 20 mesh Alumină activată UG 1)

4.8.

Substantă standard Monenzin de sodiu de activitate

cunoscută

'

5.

Aparatură

5.1.

Evaporator rotativ în vid, cu balon cu fund rotund de 250 ml.

5.2.

Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 25 mm, lungime: aproximativ 400 mm cu deschidere efilată de 2 mm diametru la o extremitate.

5.3.

Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 11 mm, lungime: aproximativ 300 mm deschidere efilată de 2 mm diametru la o extremitate.

6.

Solutii etalon

Se diz ' olvă o cantitate precis cântărită din substanța

°

standard (4.8) în metanol (4.4) și se diluează pentru a se obține soluția stoc ce conține 800 µg /ml monenzin de sodiu. Se păstrează în flacoane închise la 4

C. Această soluție este stabilă timp de maxim două săptămâni.

Din această soluție stoc se prepară, prin diluție succesivă cu 50% metanol, (4.6) următoarele soluții

Sa

-

8.0 µg/ml S4 - 4.0 µg/ml S2 - 2.0 µg/ml S1

---

1.0 µg/ml

7.

Prepararea extractului

7.1.

Extracție

7.1.1.

Premixuri

Se cântărește o cantitate de probă de 2 g, se adaugă 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizează și se centrifughează timp de câteva minute. Se diluează soluția de supernatant cu

metanol 50% (4.6) pentru a se obține ·

un conținut dorit de monenzin de sodiu de 8 µg /ml (

=

U 8

)

7.1.2.

Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu maxim de 50pmm

Se cântărește o cantitate de probă de 10-20 g, se adaugă 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizează timp de 15 minute și se lasă să se limpezească.

Se introduce un tampon de vată în deschiderea efilată a tubului de sticlă (5.2) și se adaugă oxid de aluminiu (4.7) și se scutură ușor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm

înăltime.

'

Se decantează extractul pe coloana de oxid de aluminiu și

se colectează filtratul, se diluează 30 ml până la 50 ml filtrat cu apă. Se fac următoarele diluții cu metanol 50% (4.6) până se obține un conținut dorit de monenzin de sodiu de 8 µg /ml (

=

Ua)

7.1.3.

Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu mai mic de 50 pmm ( până la limita de 1O ppm)

Se cântărește o cantitate de probă de 10-20 g, se adaugă

100 ml metanol 90% (4.5) și se omogenizează timp de 15 minute. Se centrifughează până devine limpede.

°

Se prelevează 40 ml lichid supernatant pentru o probă ce conține 20 ppm monenzin de sodiu. Se prelevează 80 ml pentru o probă ce conține 1O ppm și se evaporă până la uscare sub vid la un evaporator rotativ (5.1) la maxim 40

C, se dizolvă reziduul în 1O ml metanol 90% (4.5).

Se introduce un tampon de vată în deschiderea efilată a tubului de sticlă (5.3) și se adaugă oxid de aluminiu (4.7) și scutură ușor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm

înăltime.

'

Se

decantează

soluția

metanoică

de reziduu

de pe

coloana de oxid de aluminiu și se colectează filtratul. Se spală coloana cu 1O ml metanol 90% (4.5) și se combină lichidele de spălare cu filtratul.

°

Se evaporă soluția până la uscare sub vid la un evaporator

rotativ (5.1), la maxim 40

C. Se dizolvă reziduul în 1O ml metanol anhidru

(4.4)

și se aduce la semn cu 20 ml apă. Se centrifughează soluția la minim 4000 r/min, timp de cel puțin

cinci minute. Se fac următoarele diluții cu

metanol 50% (4.6) până se obține un conținut dorit de monenzim de sodiu de 8 µg

/ml ( = Ua)

7.2.

Soluții probă

Pentru soluția U 8

se prepară soluțiile U4 (conținut evaluat: 4 µg/ml), U 2 (conținut evaluat: 2 µg/ml) și U 1 (conținut evaluat: 1 µg/ml) prin diluții succesive (1+1) cu metanol 50% (4.6).

8.

Procedura de testare

8.1.

Însământarea mediului de testare

Se însămânțe '

ază mediul de testare

(4.2)

cu suspensie de

spori (3.2) la 50-60 °c. Prin experimente preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2). se determină cantitatea de suspensie de spori necesară pentru a determina cele mai întinse și mai clare

zone de inhibitie cu diferite concentratii în monenzin de sodiu.

8.2.

Prepa '

rarea plăcilor de însăm '

ânțare

Difuzia pe agar este efectuată în plăci, utilizâdu-se patru concentrații din soluția etalon (Sa S4 S2 S1 ) și patru concentrații din soluția probei (Ua, U4,U2, U 1 ). Aceste patru concentrații ale extractului și etalonului trebuie, în mod necesar, să fie plasate

în fiecare placă. În acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a permite să fie realizate în mediu de agar cel puțin opt godeuri cu un diametru de 1O până la 13 mm și la nu mai puțin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe plăci formate dintr-o placă de sticlă cu o față din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru și 20 mm înălțime.

Se toarnă în plăci o cantitate din mediul (4.2), însămânțat cum este indicat la punctul 8.1., pentru a se obține un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri și se pun în acestea volume de probă exact măsurate și soluții standard (între O,1O și O,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentrație de cel puțin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie.

8 '

.3. lncubatie

Se incubea ' ză plăcile timp de aproximativ 18 ore, la 35 -

37°c.

9.

Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiție cu o aproximație de O,1 mm. Se înregistrează valorile •medii pentru fiecare concentrație

pe

hârtie

grafică

semi-logaritmic

ce

indică logaritmul concentrațiilor în raport cu, diametrul zonelor de inhibiție. Se trasează liniile cele mai potrivite atât pentru soluția etalon cât și pentru extract ca în exemplul de mai jos.

Se determină

punctul

ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel (SL) utilizând formula:

a)

S = L

7S 1

+4S2 +S-42S8

10

Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul

standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula:

b)

SH=

7S8+4S4 +S-22S

1

10

Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) și nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U1,U2 și U4 cu S1, S2 și S4 și S 8

din formula menționată mai sus.

Se înregistrează

valorile calculate

ale SL și SH, pe aceeași hârtie grafică și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluția etalon. Se înregistrează în mod similar UL și UH și se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract.

În

absenta

oricărei

interferente

liniile

trebuie

să

fie

paralele.

Pentr '

u

scopuri

practice

l ' iniile

pot

fi

considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora.

Dacă liniile nu sunt paralele fie U 1

și S 1

fie U 8

și S 8

pot fi eliminate

și

SL,

SH,

UL

și

UH

calculate,

utilizând

formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite".

(a')

S = L

5S1 +2S2 -2S4

sau

5S2 +2S4 -S8

6

6

(b')

sH

=

ss4 +2s-2s

1

sau

5S8+2s-4s2

6

6

și în mod similar pentru UL și UH. Trebuie să fie respectate aceleași criterii de paralelism Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activității relative '(log A) prin intermediul uneia din următoarele formule:

Pentru patru nivele

(c)

LogA =

(Ul +U

2

+U4

+U

g

-S\ -S

2

-S4-S

g

)

X

0

,

602

U

4

+U 8

+S 4

+S 8

-U, -U

2

-S, -S 2

Pentru trei nivele

(d)

LogA=

(U, +U

2

+U

4

-S, -S

2

-S

4

)X0

,

401

U4

+S4

-Ul

-s,

sau

(d')

LogA

=

(U

2

+U4

+U 8

-S 2

-S

4

-S 8 )x0

,

401

U 8

+S 8

-U 2

-S 2

Activitatea reală - activitatea presupusă x activitatea reală Dacă activitatea relativă este în afara gamei de valori

cuprinse între 0,5 și 2,0, atunci se repetă proba făcând ajustări corespunzătore ale concentrațiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale soluțiilor etalon. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obținut trebuie să fie considerat

ca aproximativ

și acesta trebuie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este totuși realizat,

înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare.

1O. Repetabilitate

'

Diferența între rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceleași probă prin aceeași analiză nu trebuie să depășească

-

20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 1O până la 25 mg/kg,

-

5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg,

-

10% raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.

i(1) Pot fi utilizate alte metode ,

cu condiția să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii de spori similare

( a ) Poate fi utilizat orice m e diu

co mercial de cultură de compoziție similară ce oferă aceleași rezultate

( b )

1 mg monenzin de sodiu este echivalent cu 1000 unități UK

AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR

O R D I N

pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză

pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor și grăsimilor brute și a olaquindoxului din furaje*)

În temeiul prevederilor art. 10 lit. b) din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru

Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia,

văzând Referatul de aprobare nr. 154.288 din 28 mai 2004 al Direcției generale veterinare,

președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin:

Articolul 1

— Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode

naționale

de

analiză

pentru

determinarea aminoacizilor,

uleiurilor

și

grăsimilor

brute

și

a olaquindoxului din furaje, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art.

2.

—

Institutele

centrale

de

profil,

direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a

municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Articolul 3

— Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin.

Articolul 4

— Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor,

Liviu Harbuz

București, 10 iunie 2004.

Nr. 20.

*) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 20/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis.

**) Anexa este reprodusă în facsimil.

ANEXĂ

NORMĂ VETERINARĂ

ce stabilește metode naționale de analiză pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor și grăsimilor brute și a olaquindoxului din furaje

ANEXĂ

la norma veterinară

cromatografie cu schimbători de ioni și determinați prin reacția cu ninhidrină utilizând detectarea fotometrică la lungimea de undă de 570 nm (440 nm pentru pralină).

3.

Reactivi

Trebuie să se utilizeze apă bidistilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate<1O µS).

3.1.

Peroxid de hidrogen, w=30 %

3.2.

Acid formic, w=98-100

°/o

3.3.

Fenol

3.4.

Disulfit de sodiu

3.5.

Hidroxid de sodiu

3.6.

Acid 5-sulfosalicilic dihidrat

3.7.

Acid clorhidric, densitate aproximativ 1,18 g/ml

3.8.

Citrat de trisodiu dihidrat

3.9.

2,2' - Tiodietanol (tiodiglicol)

3.1 O.

Clorură de sodiu

3.11.

Ninhidrină

3.12.

Eter de petrol cu interval de fierbere 40-60

°c

3.13.

Norleucină sau alt compus corespunzător pentru a fi

utilizat ca standard intern.

3.14.

Azot gazos (<1O ppm oxigen)

3.15.

1-Octanol

3.16.

Aminoacizi

3.16.1.

Substanțe

standard

enumerate

la

punctul

1. Compuși puri ce nu conțin apă de cristalizare. Se usucă sub vid sub flux de P2O 5

sau H2SO4 timp de o săptămână înainte de utilizare.

3.16.2.

Acid cisteic

3.16.3.

Metionin sulfonă

3.17.

Soluție hidroxid de sodiu, c=7,5 mol/I:

Se

dizolvă 300 g NaOH (3.5.) în apă și se aduce la 1 litru.

3.18.

Solutie hidroxid de sodiu, c=1 mol/I:

Se dizolvă 40 g '

NaOH (3.5.) în apă și se aduce la 1 litru

3.19.

Solutie acid formic - fenol:

Se amestecă 88 '

9 g acid formic (3.2) cu 111 g apă și se adaugă

4,73 g fenol (3.3).

'

3.20.

Amestec de hidroliză, c=6 mol HCI/I ce cantine 1 g

•

fenol/I:

Se adaugă 1 g fenol (3.3) la 492 ml HCI (3.7) și se aduce la 1 litru cu apă.

3.21.

Amestec de extracție, c=0,1 mol HCI/I ce conține 2% tiodiglicol:

Se iau 8,2 ml HCI (3.7), se diluează cu aproximativ 900 ml apă, se adaugă 20 ml tiodiglicol (3.9) și se aduce la 1 litru cu apă, (nu se amestecă direct 3.7 și 3.9)

3.22.

Acid 5-sulfosalicilic, ț3 = 6%:

Se dizolvă 60 g acid 5-sulfosalicilic (3.6) în apă și se aduce la 1 litru cu apă.

3.23.

Amestec de oxidare (Acid performic-fenol):

Se amestecă 0,5 ml peroxid de hidrogen (3.1) cu 4,5 ml soluție de acid formic-fenol (3.19) într-un pahar mic. Se incubează la 20-30 °c timp de 1 oră pentru obținerea acidului performic, apoi se răcește pe o baie de apă cu gheață (15 min) înainte de adăugarea la probă.

Atenție: Se evită contactul cu pielea și se poartă haine de protecție.

3.24.

Tampon citrat, c=0,2 mol Na+/1, pH 2,20:

Se dizolvă 19,61g citrat de sodiu (3.8), 5 ml tiodiglicol (3.9), 1 g

fenol (3.3) și 16,50 ml HCI (3.7) în aproximativ 800 ml apă. Se aduce pH-ul la 2,20. Se aduce la 1 litru cu apă.

3.25.

Tampoane de eluție preparate în conformitate cu condițiile prevăzute pentru analizorul utilizat (4.9).

3.26.

Reactiv

ninhidrină

preparat

în

conformitate

cu condițiile prevăzute pentru analizorul utilizat (4.9).

3.27.

Solutii etalon de aminoacizi. Aceste solutii trebuie să fie păstrate la o'temperatură mai mică de

s 0 c.

'

3.27.1.

Soluție standard stoc de aminoacizi (3.16.1) c=2,5 µmol/ml

din

fiecare

în

acid

clorhidric.

Poate

fi

obținută comercial.

3.27.2.

Soluție standard stoc de acid cisteic și metionin sulfonă c=1,25 µmol/ml.

Se dizolvă 0,2115 g acid cisteic (3.16.2) și 0,2265 g metionin sulfonă în tampon citrat (3.24), într-un balon cotat de 1 litru și se aduce la semn cu tampon citrat. Se păstrează la o temperatura mai mică de 5° C maxim 12 luni. Această soluție nu poate fi

utilizată dacă soluția standard stoc (3.27.1) conține cisteic și metionină sulfonă.

3.27.3.

Solutie standard stoc a standardului intern, ex.

norleucină c=20 µm '

ol/ml.

Se dizolvă 0,6560 g norleucină (3.13) în tampon citrat (3.24), într-un balon cotat și se aduce la 250 ml cu tampon citrat. Se păstrează la o temperatura mai mică de 5° C timp de maxim 6 luni.

3.27.4.

Solutie de etalonare

a aminoacizilor

standard pentru utilizare cu '

hidrolizate, c=5 nmol/50µI de acid cisteic și

metionin sulfonă și c=1O nmol/50µI a altor aminoacizi.

Se dizolvă 2,2 g clorură de sodiu (3.1O) într-un pahar gradat de 100 ml cu 30 ml tampon citrat (3.24}. Se adaugă 4,00 ml soluție standard stoc de aminoacizi (3.27.1), 4,00 ml soluție standard stoc de acid cisteic și metionină sulfonă (3.27.2.) și 0,50 ml soluție standard stoc de standard intern, (3.27.3) dacă este utilizat. Se aduce pH-ul la 2,20 cu hidroxid de sodiu (3.18).

Se transferă cantitativ, într-un balon cotat de 50 ml și se aduce

la semn cu tampon citrat (3.24) și se amestecă.

Se păstrează la o temperatura mai scăzută de 5 °e, timp de maxim 3 luni.

Vezi de asemenea observațiile de la punctul 9.1.

3.27.5.

Solutie de etalonare a aminoacizilor

standard pentru utilizarea c '

u hidrolizate preparate în conformitate cu

punctul 5.3.3.1. și destinate a fi utilizate cu extracte (5.2). Soluția de etalonare este preparată în conformitate cu punctul ·

3.27.4, dar fără clorură de sodiu.

Se păstrează la o temperatura mai scăzută de 5 °e, timp de maxim 3 luni

4.

Aparatură

4.1.

Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml prevăzut cu refrigerent de reflux.

4.2.

Flacon de sticlă borosilicică, cu capac filetat, cu

garnitură de cauciuc/teflon, (ex. Duran, Schott) pentru utilizare în etuvă.

4.3.

Etuvă cu ventilație forțată și regulator de temperatură, cu o precizie mai mare de

+

2 °e.

4.4.

pH - metru (gradație de trei zecimale)

4.5.

Filtru cu membrană (0,2 µm)

4.6.

Centrifugă

4.7.

Evaporator rotativ cu vid.

4.8.

Agitator mecanic sau magnetic

l

l

4.9.

Analizor de aminoacizi sau echipament

HPLe cu coloană

schimbătoare

de ioni,

dispozitiv

pentru

ninhidrină, derivație

post-coloană

și detector

fotometric.

Coloana

este prevăzută

cu

rășini

polistiren

sulfonate,

pentru

separarea diferiților

aminoacizi

unul

de celălalt

și

din

alte materiale ninhidrin pozitive. Debitul de tampon și ninhidrină este asigurat de pompe având un grad de stabilitate a fluxului de

±

0,5% în perioada ce acoperă ambele soluții standard de etalonare și de analiză a probei. Cu aceleași analizoare de aminoacizi se pot utiliza metode de hidroliză în care hidrolizatul are o concentratie de sodiu de c=0,8 mol/I și conține tot acidul formic rezidual provenit

din

oxidare.

Altele

nu

pot

asigura

o

separare satisfăcătoare a unor

aminoacizi,

dacă

hidrolizatul

cantine exces e

acid formic și/sau concentrație crescută a ionilor de sodiu. ln acest caz volumul de acid este redus prin evaporare la aproximativ 5 ml, după hidroliză și anterior de ajustarea pH-ului. Evaporarea trebuie să se facă sub vid, la maxim 40 °e.

5.

Metodă de lucru

5.1.

Prepararea probei

Proba este măcinată pentru a trece printr-o sită de 0,5

mm. Probele cu umiditate ridicată trebuie, înainte de măcinare, uscate fiecare la aer, la o temperatură ce maxim 50 °e sau prin liofilizare.

Probele cu un conținut mare în grăsimi trebuie extrase cu eter de petrol (3.12), înainte de măcinare.

5.2.

Determinarea

aminoacizilor

liberi

din

furaje

și premixuri

Se cântărește,

cu o precizie

de 0,2 mg, o cantitate corespunzătoare (1-5 g) de probă preparată (5.1), într-un pahar conic și se adaugă 100,0 ml amestec de extracție (3.21). Se agită amestecul timp de 60 minute utilizând un agitator mecanic sau un agitator magnetic (4.8). Sedimentul se lasă să se decanteze și se pipetează 1O ml din soluția de supernatant într­ un pahar de 100 ml.

Se

adaugă

5

ml

soluție

de

acid

sulfosalicilic

(3.22) agitându-se și se continuă să se agite cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru îndepărtarea oricărui precipitat. Se pun 1 O

ml din soluția ce rezultă într-un pahar de 100 ml și se aduce pH­ ul la 2,20, utilizându-se soluție de hidroxid de sodiu (3.18). Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător, utilizându­ se

tampon

citrat

(3.24)

și

se

aduce

la

semn

cu

soluție tampon(3.24).

Dacă este utilizat un standard intern, se adaugă 1,00 ml standardul intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml soluție finală și se aduce la semn cu soluție tampon (3.24).

Se trece la etapa de cromatografie în conformitate cu punctul 5.4.

Dacă extractele existente nu sunt examinate în aceeași zi, acestea trebuie să fie păstrate la o temperatură mai scăzută de

5

°c.

5.3.

Determinarea aminoacizilor totali

5.3.1.

Oxidare

Se cântărește cu o precizie de 0,2 mg, de la

O, 1 la1 g de probă preparată (5.1) într-un:

(i)

balon cu fund rotund de 100 ml (4.1), pentru hidroliză deschisă (5.3.23) sau,

(ii)

balon cu fund rotund de 250 ml (4.1), dacă se cere o concentrație scăzută de sodiu (5.3.3.1) sau,

(iii)

flacon de 100 ml prevăzut cu un capac filetat

(4.2)

(pentru hidroliză închisă 5.3.2.4.)