Ordinul nr. 586/2007

Secțiunea I Lista plantelor-gazdă ale bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute la art. 1

Plante (inclusiv tuberculi), altele decât semințele propriu-zise de Solanum tuberosum L (cartof)

Plante, altele decât fructele și semințele de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw (tomate)

Secțiunea II Inspecții

1. Inspecțiile prevăzute la art. 3 din ordin se bazează pe biologia organismului și pe sistemele de producție proprii:

(i) în cazul cartofului:

- în perioade corespunzătoare, inspecția vizuală a culturii și/sau prelevarea de probe atât de cartofi de sămânță, cât și de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetație sau în perioada de depozitare. Aceste probe sunt supuse unei inspecții vizuale prin secționarea tuberculilor; și

- în cazul cartofilor de sămânță și, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda stabilită în anexa nr. II;

(îi) în cazul tomatelor:

- inspecție vizuală, în perioade corespunzătoare, cel puțin în perioada de vegetație a plantelor destinate replantării în scop profesional.

2. Notificarea inspecțiilor prevăzute la art. 4 alin. (1) din ordin include:

(i) în cazul inspecțiilor asupra cartofilor:

- suprafața totală estimată cultivată, în hectare, cu cartofi de sămânță și alte tipuri de cartofi;

- stratificarea după categorie a cartofilor de sămânță și de consum și, după caz, pe regiune;

- numărul și perioada de prelevare a probelor pentru testare;

- numărul inspecțiilor vizuale din câmp;

- numărul de inspecții vizuale asupra tuberculilor și dimensiunea probei;

(îi) în cazul inspecțiilor la plantele de tomate destinate replantării în scop profesional, în perioada de vegetație:

- numărul total estimat de plante;

- numărul inspecțiilor vizuale;

(iii) în cazul inspecțiilor asupra plantelor-gazdă, altele decât cartofi și tomate, inclusiv plante-gazdă solanacee sălbatice:

- speciile;

- numărul și perioada prelevării probelor;

- zona/râul de unde au fost prelevate probele, acolo unde este cazul;

- metoda de analiză;

(iv) în cazul inspecțiilor asupra apei și deșeurilor lichide deversate din procesarea industrială sau din locurile de ambalare:

- numărul și perioada prelevării probelor;

- zona/râul/ locul de prelevare a probelor, acolo unde este cazul;

- metoda de analiză.

Secțiunea I Aplicarea protocolului de testare

1. Procedura de detecție pentru diagnoza veștejirii bacteriene (Ralstonia solanacearum) la tuberculi de cartof, plante de cartof, plante de tomate sau alte plante-gazdă care prezintă simptome de veștejire bacteriană
Protocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof și plantelor cu simptome tipice sau suspecte de veștejire bacteriană. Presupune un test de detecție rapidă, izolarea agentului patogen din țesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) și, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.
Prezentarea diagramei
┌──────────────────────────────────────────────────────────────┐
│Tubercul(i) de cartof(i) sau planta(palante) gazda de cartofi,│
│tomate sau alte plante gazda care prezinta simptome suspecte
│
│de vestejire bacteriana*1)
│
└────────────────────────┬─────────────────────────────────────┘
│
│
┌───────────────────────────────────────┐
│
│TESTE DE SELECTIE RAPIDĂ*2)
│
│
│A se efectua cel puțin unul dintre
│
├───┤urmatoarele teste pentru un diagnostic │
│
│prezumtiv:
│
│
│- test de eliminare a exudatului din
│
│
│tesutul vascular al tulpinii*3)
│
│
│- test de detectare a granulelor -
│
│
│hidroxibutirat*4)
│
│
│- test de sero-aglutinare*5)
│
│
│- test IF*6)/test FISH*7)/testELISA*8)/│
│
│testPCR*9)
│
│
└───────────────────────────────────────┘
│
┌──────────┴──────────┐
│ TEST DE IZOLARE*10) │
└──────────┬──────────┘
│
┌──────────┴──────────┐
│Colonii cu morfologie│
│
tipica*11)
│
└──────────┬──────────┘
│
┌───────────────────┐
│
┌──────┐
│R.solanacearum
│
├──────┤NU*12)├────┤
nedetectata
│
│
└──────┘
│proba necontaminata│
│
│cu R.solanacearum
│
│
└───────────────────┘
┌──┴──┐
│ DA
│
└──┬──┘
│
┌─────────────┴───────────────┐
│ Purificare prin subcultura
│
└─────────────┬───────────────┘
│
┌─────────────────┐
│
┌───────────────────┐
│
TESTE DE
├───┼───┤
TEST DE
│
│ IDENTIFICARE*13)│
│
│
PATOGENITATE*14) │
└─────────────────┘
│
└───────────────────┘
│
┌─────────────┴──────────────────┐
│
Cele doua teste confirma o
│
│ cultura pura de R.solanacearum │
└─────────────┬──────────────────┘
│ ┌────┐
┌──────────────────────┐
├─┤ NU ├────┤proba necontaminata cu│
│ └────┘
│
R.solanacearum
│
│
└──────────────────────┘
┌─┴──┐
│ DA │
└─┬──┘
│
┌─────────┴────────────┐
│ proba contaminata cu │
│
R.solanacearum
│
└──────────────────────┘
___________
*1) Descrierea simptomelor este prevăzută la secțiunea II.1.
*2) Testele de selecție rapidă ușurează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esențiale. Un rezultat negativ nu garantează întotdeauna absența agentului patogen.
*3) Testul de eliminare a exsudatului din țesutul vascular al tulpinii este descris în secțiunea VI.A.1.
*4) Testul de detecție a granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat în celulele bacteriene este descris în secțiunea VI.A.2.
*5) Testele de seroaglutinare asupra exsudatului bacterian sau asupra extractelor din țesuturile simptomatice sunt descrise în secțiunea VI.A.3.
*6) Testul IF asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din țesuturi simptomatice este descris în secțiunea VI.A.5.
*7) Testul FISH asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din țesuturi simptomatice este descris în secțiunea VI.A.7.
*8) Testul ELISA asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din țesuturi simptomatice este descris în secțiunea VI.A.8.
*9) Testul PCR asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din țesuturi simptomatice este descris în secțiunea VI.A.6.
*10) În general, agentul patogen se izolează ușor din materialul vegetal simptomatic prin însămânțare pe mediu nutritiv (secțiunea II.3).
*11) Morfologia coloniei tipice este descrisă în secțiunea II.3.d).
*12) Cultivarea riscă să eșueze în stadiile avansate de infectare din cauza concurenței sau a înmulțirii bacteriilor saprofite. În cazul în care simptomele bolii sunt caracteristice, dar testul de izolare este negativ, izolarea trebuie repetată, de preferință printr-un test de însămânțare pe medii selective.
*13) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secțiunea VI. B. O caracterizare subspecifică este facultativă, dar recomandată pentru fiecare caz nou.
*14) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI. C.
2. Procedura pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici
Principiu
Protocolul de testare este destinat detecției infecțiilor latente ale tuberculilor de cartof. Un rezultat pozitiv a cel puțin două teste de detecție bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanacearum. Un rezultat pozitiv la un singur test de detecție nu este suficient pentru a considera proba ca fiind suspectă.
Testele de detecție și testele de izolare trebuie să permită detecția a 10^3-10^4 celule pe ml de extract concentrat în suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.
Prezentarea diagramei
┌───────────────────────────────┐
│Proba de tuberculi de cartof*1)│
└─────────────┬─────────────────┘
│
┌─────────────┴─────────────────┐
│Extragerea și concentrarea
│
│
agentului patogen*2)
│
└─────────────┬─────────────────┘
│
┌─────────────┴────────────────────┐
│
TESTELE DE SELECTIE*3)
│
│ Test IF*4)/izolare selectiva*5)/ │
│
testPCR*6)/testFISH*7)
│
│ Test auxiliar facultativ:ELISA*8)│
└──────────────┬───────────────────┘
│
┌───────────┴────────────────┐
│ Primul test de selecție*3) │
└───────────┬────────────────┘
│
┌───────┐
┌──────────────────────┐
├───┤negativ├────┤ R.solanacearum
│
│
└───────┘
│
nedetectat
│
┌──┴────┐
│proba necontaminata cu│
│pozitiv│
│ R.solanacearum
│
└───┬───┘
└──────────────────────┘
│
┌──────────────┴───────────────┐
│ Al doilea test de selecție*3)│
└─────────────┬────────────────┘
│
┌───────┐
┌──────────────────────┐
├───┤negativ├────┤ R.solanacearum
│
│
└───────┘
│
nedetectat
│
┌──┴────┐
│proba necontaminata cu│
│pozitiv│
│ R.solanacearum
│
└───┬───┘
└──────────────────────┘
│
┌───────────────────┴───────────────────────┐
│izolare selectiva*5)și/sau test biologic*9)│
└───────────────────┬───────────────────────┘
│
┌─────────────┴──────────────────┐
│Colonii cu morfologie tipica*10)│
└─────────────┬──────────────────┘
│
│
┌──────┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU*11)├───┤ R.solanacearum
│
│
└──────┘
│
nedetectat
│
┌─┴──┐
│proba necontaminata cu│
│ DA │
│ R.solanacearum
│
└─┬──┘
└──────────────────────┘
│
┌───────────┴───────────────┐
│ Purificare prin subcultura│
└───────────┬───────────────┘
┌────────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│TESTE DE IDENTIFICARE*12├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*13│
└────────────────────────┘
│
└───────────────────────┘
┌────────────────┴────────────────┐
│ ambele teste confirma o cultura │
│
pura de R.solanacearum
│
└────────────────┬────────────────┘
│
┌──┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│
│
└──┘
│
R.solanacearum
│
│
└──────────────────────┘
┌──┴─┐
│ DA │
└──┬─┘
┌────────┴────────────┐
│proba contaminata cu │
│
R.solanacearum
│
└─────────────────────┘
_____________
*1) Mărimea standard a probei este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat probelor mai mici în cazul în care nu sunt disponibili 200 de tuberculi.
*2) Extragerea agentului patogen și metodele de concentrare sunt descrise în secțiunea III.1.1.
*3) În cazul în care cel puțin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea și confirmarea. A se efectua cel puțin un test rapid de detecție. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecție rapidă bazate pe principii biologice diferite pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.
*4) Testul IF este descris în secțiunea VI.A.5.
*5) Testul de izolare selectivă este descris în secțiunea VI.A.4.
*6) Testele PCR sunt descrise în secțiunea VI.A.6.
*7) Testul FISH este descris în secțiunea VI.A.7.
*8) Testele ELISA sunt descrise în secțiunea VI.A.8.
*9) Testul biologic este descris în secțiunea VI.A.9.
*10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secțiunea II.3.d).
*11) Cultivarea sau testele biologice riscă să eșueze din cauza concurenței sau a inhibiției de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obțin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecție, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare din același extract concentrat sau din țesutul vascular suplimentar prelevat de la talonul tuberculilor tăiați din aceeași proba și, după caz, trebuie testate probele suplimentare.
*12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secțiunea VI.B.
*13) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI.C.
3. Procedură pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de plante-gazdă de cartofi și tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice
Prezentarea diagramei
┌─────────────────────────────────┐
│ Probe de segmente din tulpina*1)│
└───────────────┬─────────────────┘
│
┌────────────────────────┴─────────────────────────┐
│Extragerea și concentrarea organismului patogen*2)│
└────────────────────────┬─────────────────────────┘
│
┌────────────────────────────┴──────────────────────┐
│
TESTE PRINCIPALE DE DEPISTARE*3)
│
│
Izolare selectiva*4)/testIF*5)/testPCR*6)/
│
│
test FISH*7)
│
│Test auxiliar facultativ: ELISA*8),test biologic*9)│
└────────────────────────────┬──────────────────────┘
│
│
┌──────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│ Colonii cu morfologie│
│
│toate testele efectuate│
│
tipica după
├───┴────┤
sunt negative
│
│
izolare*8
│
└───────────────────────┘
└─────────────┬────────┘
│
│
┌──────┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU*11)├───┤ R.solanacearum
│
│
└──────┘
│
nedetectat
│
┌─┴──┐
│proba necontaminata cu│
│ DA │
│ R.solanacearum
│
└─┬──┘
└──────────────────────┘
│
┌───────────┴───────────────┐
│ purificare prin subcultura│
└───────────┬───────────────┘
┌────────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│TESTE DE IDENTIFICARE*12├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*13│
└────────────────────────┘
│
└───────────────────────┘
┌────────────────┴────────────────┐
│ ambele teste confirma o cultura │
│
pura de R.solanacearum
│
└────────────────┬────────────────┘
│
┌──┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│
│
└──┘
│
R.solanacearum
│
│
└──────────────────────┘
┌──┴─┐
│ DA │
└──┬─┘
┌────────┴────────────┐
│proba contaminata cu │
│
R.solanacearum
│
└─────────────────────┘
_________________
*1) Pentru mărimea recomandată a probelor a se vedea secțiunea III.2.1.
*2) Extragerea agentului patogen și metodele de concentrare sunt descrise în secțiunea III.2.1.
*3) În cazul în care cel puțin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea și confirmarea. A se efectua cel puțin un test rapid de detecție. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecție rapidă, bazate pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.
*4) Testul de izolare selectivă este descris în secțiunea VI.A.4.
*5) Testul IF este descris în secțiunea VI.A.5.
*6) Testele PCR sunt descrise în secțiunea VI.A.6.
*7) Testul FISH este descris în secțiunea VI.A.7.
*8) Testele ELISA sunt descrise în secțiunea VI.A.8.
*9) Testul biologic este descris în secțiunea VI.A.9.
*10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secțiunea II.3.d).
*11) Cultivarea sau testele biologice riscă să eșueze din cauza concurenței sau a inhibiției de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obțin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecție, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare.
*12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolări prezumtive de Ralstonia solanacearum se obține prin efectuarea testelor descrise în secțiunea VI.B.
*13) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI.C.

Secțiunea II

Metode detaliate pentru detecția bacteriei Ralstonia solanacearum la tuberculii de cartof, la plantele-gazdă de cartof și de tomate sau la alte plante-gazdă cu simptome de vestejire bacteriană

1. Simptome (vezi website http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Simptome la cartof

Pe plante. Stadiul incipient al infecției în câmp este reprezentat de veștejirea frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate și de revenirea la aspect normal în timpul nopții. În cursul primelor stadii de veștejire, frunzele rămân verzi, dar mai târziu apare o îngălbenire și o necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Veștejirea unui lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă și duce la moartea plantei. Țesutul vascular în secțiune transversală prin tulpina plantelor veștejite poate deveni brun și un exsudat lăptos apare la suprafața tăieturii sau poate fi extras ușor prin presare. Dacă tulpina secționată se așază în poziție verticală în apă, din țesutul vascular se elimină un exsudat vâscos asemănător unui firicel.

Pe tuberculi. Se secționează tuberculii de cartof transversal aproape de hil (punctul de inserție cu stolonul) sau longitudinal până la stolon. În stadiul incipient al infecției apare o decolorare galben-sticloasă spre brun-deschis a inelului vascular din care se elimină un exsudat crem-pal în mod spontan după câteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la țesutul parenchimatos. În stadii avansate, infecția se propagă la nivelul stolonilor și al ochilor din care se elimină bacterii ce permit aderarea particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare brun-roșcat ușor adâncite, provocate de colapsul intern al țesutului vascular. În stadiile avansate ale bolii se dezvoltă putregaiuri fungice și bacteriene.

1.2. Simptome la tomate

Pe plante. Primul simptom vizibil este veștejirea aparentă a frunzelor tinere. În condiții favorabile agentului patogen (temperatura solului circa 25°C, umiditate saturată), în câteva zile apar epinastia și veștejirea unei părți din plantă sau a întregii plante, ce duc la colapsul total al plantei. În condiții mai puțin favorabile (temperatura solului sub 21°C), veștejirea este mai puțin pronunțată, dar se poate dezvolta un număr mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă observarea unei benzi subțiri unsuroase de-a lungul tulpinii, plecând de la baza acesteia, ce dovedește necroza sistemului vascular. În cazul în care tulpina este secționată transversal, din țesuturile vasculare brun-decolorat ale tulpinii se elimină un exsudat bacterian alb sau gălbui.

1.3. Simptome la alte plante-gazdă

Solanum dulcamara și Solanum nigrum. În condiții naturale rareori se observă simptome de veștejire la aceste plante-gazdă, cu excepția cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25°C sau nivelurile de inoculum sunt extrem de ridicate (de exemplu, pentru Solanum nigrum care se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomate bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sunt identice cu cele descrise pentru tomată. Plantele de Solanum dulcamara care nu se veștejesc și se dezvoltă cu tulpina și rădăcina în apă pot prezenta o ușoară decolorare brună a țesutului vascular pe partea transversală a tulpinii sau pe părțile tulpinii aflate sub apă. În cazul în care se pune o tulpină tăiată în poziție verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian chiar în absența simptomelor de veștejire.

2. Teste rapide de detecție

Testele rapide de detecție facilitează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esențiale. Se folosesc unul sau mai multe dintre următoarele teste validate:

2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină (vezi secțiunea VI.A.1)

2.2. Detecția granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat (PHB)

Granulele tipice de PHB din celulele de Ralstonia solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B (vezi secțiunea VI.A.2) a frotiurilor de exsudat bacterian din țesutul infectat, fixate prin flacără pe o lamă de microscop.

2.3. Testul serologic de aglutinare (vezi secțiunea VI.A.3)

2.4. Alte teste

Alte teste rapide de detecție sunt testul IF (vezi secțiunea VI.A.5), testul FISH (vezi secțiunea VI.A.7), testele ELISA (vezi secțiunea VI.A.8) și testele PCR (vezi secțiunea VI. A.6).

3. Procedura de izolare

a) Se îndepărtează exsudatul sau secțiunile de țesut decolorat de la nivelul inelului vascular al tuberculului de cartof sau din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, plantei de tomată sau de alte plante-gazdă veștejite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă 5-10 minute pe masă.

b) Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei.

c) Se transferă 50-100 f2μl de suspensie și de diluții pe un mediu nutritiv general (NA, YPGA sau SPA; vezi apendicele 2) și/sau pe mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 2) și/sau pe un mediu selectiv validat (de exemplu, SMSA; vezi apendicele 2). Se însămânțează printr-o tehnică corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, separat, se însămânțează plăci Petrii cu o suspensie diluată de celule de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv.

d) Se incubează plăcile timp de 2-6 zile la 28°C.

- Pe mediu nutritiv general, izolatele virulente de Ralstonia solanacearum formează colonii fluide, cu margini neregulate, plate, albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează mici colonii rotunjite, nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă.

- Pe mediu tetrazoliu Kelman și pe mediu SMSA, verticilele sunt de culoare roșu-sângeriu. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează colonii mici, rotunjite, untoase, nefluide de culoare roșu-închis.

4. Teste de identificare a bacteriei Ralstonia solanacearum

Testele care permit identificarea izolatelor prezumtive de Ralstonia solanacearum sunt prevăzute în secțiunea VI.B.

Secțiunea III 1. Metode detaliate pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici

1.1. Pregătirea probei

NOTE:

- Mărimea standard a unei probe este de 200 de tuberculi. O procedură mai intensivă de prelevare implică efectuarea de teste pe mai multe probe de această mărime. O probă cu un număr mai mare de tuberculi determină o inhibiție sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se poate aplica în mod convenabil probelor cu mai puțin de 200 de tuberculi.

- Validarea tuturor metodelor de detecție descrise în continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe probe de 200 de tuberculi.

- Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de asemenea, utilizat pentru detecția prezenței bacteriei responsabile de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Opțiuni de pretratare care pot fi efectuate înaintea preparării probei:

a) Se incubează proba la 25-30°C până la două săptămâni pentru a favoriza înainte de efectuarea testelor multiplicarea eventualelor populații bacteriene de Ralstonia solanacearum.

b) Se spală tuberculii. Se utilizează dezinfectanți (compuși clorurați în cazul în care testul PCR este folosit pentru a îndepărta ADN patogen) și detergenți corespunzători între fiecare probă. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru probele cu particule de sol în exces și în cazul în care se realizează un test PCR sau o procedură de izolare directă.

1.1.1. Cu un bisturiu sau un cuțit pentru legume curat și dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului (punctul de inserție cu stolonul) fiecărui tubercul, astfel încât să fie vizibil țesutul vascular. Se taie cu atenție un miez mic de țesut vascular (con de țesut vascular) de la nivelul hilului. Cantitatea de țesut extravascular trebuie redusă la minimum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NOTĂ: Se separă tuberculii (în putrefacție) cu simptome de putregai brun și se testează separat.

În cazul în care, la îndepărtarea conului de țesut vascular de la nivelul hilului, se observă simptome de putregai brun, trebuie să se realizeze o examinare vizuală a tuberculului respectiv și o secționare a acestuia lângă hil. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel puțin două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între 4 și 10°C) în condiții de carantină corespunzătoare. Toți tuberculii, inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstrați în conformitate cu anexa nr. III.

1.1.2. Se colectează conurile în recipiente de unică folosință neutilizate care pot fi închise și/sau sigilate (în cazul în care recipientele sunt refolosite, ele trebuie spălate și dezinfectate cu compuși clorinați). Este preferabil ca conurile să fie prelucrate imediat. În cazul în care nu este posibil, acestea se depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon, pentru cel mult 72 de ore în frigider și cel mult 24 de ore la temperatura ambiantă.

Se prelucrează conurile prin una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă conurile cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) și se agită pe un agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau

b) conurile se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se mărunțesc într-un sac de macerare de unică folosință sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip "Bioreba strong gauge polythene" de 150 mm x 250 mm sterilizat prin radiații) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex).

NOTĂ: Riscul de contaminare încrucișată a probelor este considerabil în cazul în care probele sunt omogenizate într-un mixer. A se lua măsuri de precauție pentru a se evita producerea de aerosoli sau scurgeri în timpul procesului de extracție. A se utiliza palete de mixer și recipiente sterilizate pentru fiecare probă. La efectuarea testului PCR, se evită transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă măcinarea în saci de unică folosință și utilizarea de tuburi de unică folosință.

1.1.3. Se decantează supernatantul. În cazul în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de 10 minute, la o temperatură de 4-10°C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 f2μm), spălându-se filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).

1.1.4. Bacteriile se concentrează prin centrifugare la 7.000 g timp de 15 minute (sau la 10.000 g timp de 10 minute) la o temperatură de 4-10°C și se îndepărtează supernatantul fără a deranja sedimentul (extract concentrat).

1.1.5. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml tampon concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 f2μl pentru a testa Ralstonia solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus și 500 f2μl pentru referință. Se adaugă glicerol steril la concentrația finală de 10-25 % (volum) la 500 f2μl de alicote de referință și la alicota de testare rămasă, se omogenizează în vortex și se depozitează la o temperatură situată între - 16 și - 24°C (săptămâni) sau între - 68 și - 86°C (luni). Alicotele de testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de 4-10°C.

Nu se recomandă congelările și decongelările repetate.

În cazul în care extractele trebuie transportate, livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen de 24 de ore.

1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive de Ralstonia solanacearum și probele să fie tratate separat pentru a evita orice contaminare. Această condiție se aplică atât pentru lamele de imunofluorescență, cât și pentru toate testele.

1.2. Testele

A se vedea diagrama și descrierea testelor și a protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:

Izolare selectivă (vezi secțiunea VI.A.4)

Testul IF (vezi secțiunea VI.A.5)

Testele PCR (vezi secțiunea VI.A.6)

Testul FISH (vezi secțiunea VI.A.7)

Testele ELISA (vezi secțiunea VI.A.8)

Testul biologic (vezi secțiunea VI.A.9)

2. Metode detaliate pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de plante de cartof și plante de tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice

2.1. Pregătirea probei

NOTĂ: Pentru detecția populațiilor latente de Ralstonia solanacearum, se recomandă testarea unor serii de probe. Procedura poate fi aplicată cu ușurință probelor care conțin până la 200 de bucăți de tulpini. În cazul în care se efectuează supravegheri, acestea trebuie bazate pe o probă reprezentativă din punct de vedere statistic pentru populația vegetală în cauză.

2.1.1. Se colectează bucăți de tulpină de 1-2 cm într-un recipient steril închis, în conformitate cu următoarele proceduri de prelevare:

Plantule de tomată (răsaduri): cu ajutorul unui cuțit curat și dezinfectat se taie o bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului.

Plante de tomate cultivate în seră sau în câmp: cu ajutorul unui cuțit curat și dezinfectat se îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante, tăind chiar deasupra joncțiunii cu tulpina principală. Se îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui lăstar lateral.

Alte plante-gazdă: cu ajutorul unui cuțit sau al unei foarfeci de grădină curate și dezinfectate se taie o bucată de 1 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul buruienii Solanum dulcamara sau al altor plante-gazdă care cresc în apă, se taie bucăți de 1-2 cm din tulpinile care se găsesc sub apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice.

În caz de prelevare într-o anumită zonă, se recomandă să se testeze o probă reprezentativă din punct de vedere statistic de cel puțin 10 plante pe punct de prelevare pentru fiecare potențială buruiană-gazdă. Detecția agentului patogen se face în modul cel mai fiabil la sfârșitul primăverii, vara și toamna, deși infecțiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă. Gazdele cunoscute sunt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara, Solanum nigrum, Datura stramonium și alte specii din familia Solanaceae. Pelargonium spp. și Portulaca oleracea sunt, de asemenea, plante-gazdă. Printre anumite buruieni europene care pot găzdui la nivelul rădăcinii și/sau rizosferei tulpini virulente de Ralstonia solanacearum biovar 2, rasa 3, în condiții de mediu specifice, se numără Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfarra și Urtica dioica.

NOTĂ: În această etapă se poate efectua examinarea vizuală a simptomelor interne (colorație vasculară sau exsudat bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome și se testează în mod separat (vezi secțiunea II).

2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a bucăților de tulpină cu etanol de 70% și se usucă de îndată cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi se prelucrează bucățile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) și se agită pe un agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau

b) bucățile de tulpină se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un volum corespunzător de tampon de extracție (apendicele 4), cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucățile se păstrează, fără a depăși 72 de ore, la temperatură de refrigerare sau 24 de ore la temperatura ambiantă.

2.1.3. Se decantează supernatantul după o sedimentare de 15 minute.

2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi realizată prin filtrare și/sau centrifugare în conformitate cu metoda prevăzută la pct. 1.1.3-1.1.5.

2.1.5. Se împarte extractul inițial sau concentrat în două părți egale. Se păstrează jumătate la o temperatură de 4-10°C pe parcursul testului și se conservă cealaltă jumătate cu 10-25 % (volum) glicerol steril la o temperatură situată între - 16 și - 24°C (săptămâni) sau între - 68 și - 86°C (luni), în cazul în care este necesar un test suplimentar.

2.2. Teste

A se vedea diagrama și descrierea testelor și protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:

Izolarea selectivă (vezi secțiunea VI. A.4)

Testul IF (vezi secțiunea VI. A.5)

Testele PCR (vezi secțiunea VI. A.6)

Testul FISH (vezi secțiunea VI. A.7)

Testele ELISA (vezi secțiunea VI. A.8)

Testul biologic (vezi secțiunea VI. A.9)

Secțiunea IV 1. Procedură pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă

Prezentarea diagramei
┌──────────────────────┐
┌───────┤
Proba de apa*1)
│
│
└─────────┬────────────┘
│
└─────────┐
│
┌──────────────────┴────────────────┐
│
│ Concentrarea agentului patogen*2) │
│
└───────────────────────────────────┘
└─────────────────┐
┌─────────────────────────┴───────────────────────┐
│
TESTE PRINCIPALE DE SELECTIE
│
│
izolare selectiva*3)
│
│ Teste auxiliare facultative: test biologic*4)/
│
│ imbogatire PCR*5)/imbogatire ELISA*6)
│
└─────────────────────────┬───────────────────────┘
│
│
┌───────────────────────────────┴────────────┐
│ Colonii cu morfologie tipica după izolare*7│
└──────────────────┬─────────────────────────┘
│
│
┌──────┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU*8) ├───┤ R.solanacearum
│
│
└──────┘
│
nedetectat
│
┌─┴──┐
│proba necontaminata cu│
│ DA │
│ R.solanacearum
│
└─┬──┘
└──────────────────────┘
│
┌───────────┴───────────────┐
│ Purificare prin subcultura│
└───────────┬───────────────┘
┌────────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│TESTE DE IDENTIFICARE*9)├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*10│
└────────────────────────┘
│
└───────────────────────┘
┌────────────────┴────────────────┐
│ ambele teste confirma o cultura │
│
pura de R.solanacearum
│
└────────────────┬────────────────┘
│
┌──┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│
│
└──┘
│
R.solanacearum
│
│
└──────────────────────┘
┌──┴─┐
│ DA │
└──┬─┘
┌────────┴────────────┐
│proba contaminata cu │
│
R.solanacearum
│
└─────────────────────┘
_________
*1) A se vedea secțiunea IV.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.
*2) Metodele de concentrare a agentului patogen sunt descrise în secțiunea IV.2.1. Concentrarea sporește populațiile agentului patogen și ale bacteriilor saprofite concurente și este recomandată numai în cazul în care nu determină inhibarea testului de izolare.
*3) Testul de izolare selectivă este descris în secțiunea VI.A.4.
*4) Testul biologic este descris în secțiunea VI.A.9.
*5) Metodele de îmbogățire PCR sunt descrise în secțiunile VI.A.4.2 și VI.A.6.
*6) Metodele de îmbogățire ELISA sunt descrise în secțiunile VI.A.4.2 și VI.A.8.
*7) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secțiunea II.3.d).
*8) Cultivarea riscă să eșueze din cauza concurenței sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populațiile mari de saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după diluarea probei în apă sterilă.
*9) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secțiunea VI.B.
*10) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI.C.
2. Metode pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă
Principiu
Procedura de detecție validată descrisă în prezenta secțiune se aplică pentru detecția agentului patogen în probe de apă de suprafață și poate fi folosită, de asemenea, pentru a testa probele de deșeuri lichide provenite din prelucrarea cartofilor sau probele provenite din ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie reținut faptul că sensibilitatea de detecție variază în funcție de substrat. Sensibilitatea testului de izolare este afectată de populațiile de bacterii saprofite concurente care sunt, în general, mult mai numeroase în probele provenite din prelucrarea cartofilor și din ape reziduale decât în apele de suprafață. În timp ce procedura descrisă în continuare trebuie să detecteze numai 10^3 celule/l în apele de suprafață, sensibilitatea de detecție în deșeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din acest motiv, se recomandă testarea deșeurilor după eventualele tratamente de purificare (de exemplu, sedimentare sau filtrare) pe parcursul cărora se reduc populațiile de bacterii saprofite. Limitele sensibilității procedurii de testare trebuie avute în vedere atunci când se evaluează fiabilitatea rezultatelor negative obținute, după caz. Deși această procedură a fost efectuată cu succes în studiile destinate să stabilească prezența sau absența agentului patogen în apele de suprafață, limitele sale trebuie luate în considerare atunci când este utilizată în lucrări asemănătoare privind deșeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau apelor reziduale.
2.1. Pregătirea probei
NOTE:
- Detecția bacteriei Ralstonia solanacearum în apele de suprafață se face în mod mai fiabil la sfârșitul primăverii, vara și toamna, atunci când temperatura apei este mai mare de 15°C.
- Reînceperea prelevării în momente diferite pe parcursul perioadei menționate anterior în punctele de prelevare desemnate va spori fiabilitatea detecției, reducând consecințele variațiilor climatice.
- Trebuie să se țină seama de consecințele ploilor abundente și de geografia cursului apei pentru a evita efectele de diluare considerabile care pot ascunde prezența agentului patogen.
- Se prelevă probe de apă de suprafață în apropierea plantelor-gazdă în cazul în care aceste plante-gazdă sunt prezente.
2.1.1. În punctele de prelevare selecționate, probele de apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de unică folosință la o adâncime, atunci când este posibil, mai mare de 30 cm și la o distanță maximă de 2 m de la mal. Pentru deșeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau pentru apele reziduale, se colectează probe din punctul de deversare a acestora. Mărimea recomandată a probelor poate atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul în care se preferă probe mai mici, se recomandă prelevarea probelor cel puțin în 3 reprize pe punct de prelevare, fiecare probă constând din două subprobe duplicate de cel puțin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se selecționează cel puțin 3 puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei și se prelevă și din afluenții cursului de apă.
2.1.2. Se transportă probele în condiții de refrigerare (4-10°C) și la întuneric și se testează pe parcursul a 24 de ore.
2.1.3. La nevoie, probele pot fi concentrate prin una dintre următoarele metode:
a) se centrifughează 30-50 ml de subprobă la 10.000 g timp de 10 minute (sau la 7.000 g timp de 15 minute), preferabil la 4-10°C, se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4).
b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor, de 0,45 f2μm) urmată de spălarea filtratului în 5-10 ml de tampon concentrat și reținerea soluțiilor de spălare. Această metodă este adecvată pentru volume mari de probe de apă, cu conținut mic de organisme saprofite.
În general, concentrarea nu se recomandă pentru probele de deșeuri provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale, dat fiind faptul că populațiile mai mari de bacterii saprofite concurente vor avea un efect inhibitor asupra detecției bacteriei Ralstonia solanacearum.
2.2. Teste
A se vedea diagrama și descrierea testelor în apendicii corespunzători.

Secțiunea V 1. Procedură pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol

Prezentarea diagramei
┌─────────────────────┐
│
Proba de sol*1)
│
└───────────┬─────────┘
│
┌───────────────┴──────────────────┐
│
Extragerea agentului patogen
│
└───────────────┬──────────────────┘
│
┌────────────────────────────┴──────────────────────┐
│
TESTE PRINCIPALE DE SELECTIE
│
│
izolare selectiva*2)
│
│
Teste auxiliare facultative: imbogatire PCR*3)/
│
│
test biologic*4)
│
└────────────────────────────┬──────────────────────┘
│
│
┌──────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│ Colonii cu morfologie│
│
│Toate testele efectuate│
│
tipica după
├───┴────┤
sunt negative
│
│
izolare*5)
│
└───────────────────────┘
└─────────────┬────────┘
│
│
┌─────┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU*6)├────┤ R.solanacearum
│
│
└─────┘
│
nedetectat
│
┌─┴──┐
│proba necontaminata cu│
│ DA │
│ R.solanacearum
│
└─┬──┘
└──────────────────────┘
│
┌───────────┴───────────────┐
│ Purificare prin subcultura│
└───────────┬───────────────┘
┌────────────────────────┐
│
┌───────────────────────┐
│TESTE DE IDENTIFICARE*7)├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*8)│
└────────────────────────┘
│
└───────────────────────┘
┌────────────────┴────────────────┐
│ ambele teste confirma o cultura │
│
pura de R.solanacearum
│
└────────────────┬────────────────┘
│
┌──┐
┌──────────────────────┐
├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│
│
└──┘
│
R.solanacearum
│
│
└──────────────────────┘
┌──┴─┐
│ DA │
└──┬─┘
┌────────┴────────────┐
│proba contaminata cu │
│
R.solanacearum
│
└─────────────────────┘
____________
*1) A se vedea pct. V.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.
*2) Testul de izolare selectivă este descris în secțiunea VI.A.4.
*3) Metodele de îmbogățire PCR sunt descrise în secțiunile VI.A.4.2 și VI.A.6.
*4) Testul biologic este descris în secțiunea VI.A.9.
*5) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secțiunea II.3.d.
*6) Cultivarea riscă să eșueze din cauza concurenței sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populațiile mari de bacterii saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă diluție a probei.
*7) Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secțiunea VI.B.
*8) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI.C.
2. Metode pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol
Principii
Procedura de detecție validată descrisă în prezenta secțiune se aplică pentru detecția agentului patogen în probe de sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa probele de deșeuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu sunt destul de sensibile pentru a garanta detecția populațiilor de Ralstonia solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal, care ar putea apărea în probele infectate în mod natural cu aceste substraturi.
Limita de sensibilitate a acestei proceduri de testare trebuie avută în vedere la evaluarea fiabilității rezultatelor negative obținute și, de asemenea, la utilizarea sa în studiile destinate să stabilească prezența ori absența agentului patogen în soluri sau în nămol. Cel mai fiabil test de detecție a prezenței agentului patogen în solul unui câmp este plantarea unei plante-gazdă sensibile și supravegherea infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă nu va permite detecția unui nivel slab de contaminare.
2.1. Pregătirea probei
2.1.1. Prelevarea solului din câmp trebuie să respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se colectează 0,5-1 kg de sol per probă în 60 de puncte, pe o suprafață de 0,3 ha, la o adâncime de 10-20 cm (sau dintr-o grilă de 7 x 7 m). În cazul în care se suspectează prezența agentului patogen, se mărește numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafață de 0,3 ha. Înainte de testare, probele se păstrează la o temperatură de 12-15°C. Se colectează în total 1 kg de nămol provenit din prelucrarea cartofilor și nămol de epurare în locurile care reprezintă volumul total de nămol de testat. Înainte de testare, fiecare probă se amestecă bine.
2.1.2. Se împart probele în subprobe de 10-25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turații/minut) în tampon de extracție de 60-150 ml (apendice 4) timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20 steril și 10-20 g de pietriș steril.
2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul testului, la 4°C.
2.2. Teste
A se vedea diagrama și descrierea testelor în apendicii corespunzători.

Secțiunea VI Protocoale optimizate pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum

A. DIAGNOSTIC ȘI TESTE DE DETECȚIE

1. Testul eliminării exudatului bacterian din tulpină

Prezența bacteriei Ralstonia solanacearum în tulpini ofilite de cartof, tomate sau de alte plante-gazdă poate fi pusă în evidență prin următorul test simplu prezumtiv: se secționează tulpina chiar deasupra nivelului solului. Se suspendă extremitatea tăiată într-un tub cu apă curată. După câteva minute se observă scurgeri spontane și caracteristice de fire de exudat bacterian din fasciculele vasculare tăiate.

2. Detecția granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat

1. Se prepară un frotiu din exudatul bacterian scurs din țesutul infectat pe o lamă de microscop sau se prepară un frotiu dintr-o cultură de 48 de ore de pe mediu YPGA sau SPA (apendice 2).

2. Se prepară frotiuri de control pozitiv din culturi de Ralstonia solanacearum biovar 2 și, în cazul în care se consideră necesar, un frotiu de control negativ cunoscut PHB negativ.

3. Se lasă la uscat și se trece rapid partea inferioară a fiecărei lame de câteva ori prin flacără până la fixarea frotiului.

4. Se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil sau negru de Sudan și se examinează la microscop după cum urmează.

Testul cu albastru de Nil

a) Fiecare lamă se scufundă într-o soluție apoasă 1 % de albastru de Nil A și se incubează 10 minute la 55°C.

b) Se scurge soluția colorantă. Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

c) Frotiul se scufundă într-o soluție apoasă de acid acetic de 8 % și se incubează un minut la temperatura ambiantă.

d) Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă.

e) Se umezește cu o picătură de apă și se aplică o lamelă de acoperire.

f) Se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescență de 450 nm cu ulei de imersie, la o mărire de 600-1.000, folosindu-se un obiectiv de imersie în ulei sau în apă.

g) Se observă fluorescența portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la lumină albă pentru a avea certitudinea că granulele sunt intracelulare și că morfologia celulei este tipică pentru Ralstonia solanacearum.

Testul cu negru de Sudan

a) Fiecare lamelă se scufundă într-o soluție de 0,3 % negru de Sudan B în 70 % etanol și se incubează 10 minute la temperatura ambiantă.

b) Se scurge soluția colorantă și se spală rapid sub jet de apă. Se îndepărtează excesul de apă cu hârtie absorbantă.

c) Lamele se trec rapid prin xilol și se usucă cu hârtie absorbantă. Atenție! Xilolul este un produs periculos. Luați măsurile de precauție necesare și lucrați într-o hotă chimică.

d) Se scufundă lamele în soluție apoasă de safranină 0,5 % și se lasă 10 secunde la temperatura ambiantă. Atenție! Safranina este un produs periculos. Luați măsurile de precauție necesare și lucrați într-o hotă chimică.

e) Se spală sub jet de apă. Se usucă cu hârtie absorbantă și se acoperă cu o lamelă.

f) Se examinează frotiul colorat la un microscop optic, folosindu-se obiectivul de imersie la o mărire de 1.000.

g) Se observă granulele de PHB în celulele de Ralstonia solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana celulară se colorează în roz.

3. Teste serologice de aglutinare

Aglutinarea celulelor de Ralstonia solanacearum în exudatul bacterian sau în extractele de țesuturi simptomatice se observă cel mai bine folosindu-se anticorpi validați (vezi apendice 3) etichetați cu markeri colorați corespunzători, precum celulele de Staphylococcus aureus roșu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui material disponibil în comerț (vezi apendice 3), se urmează instrucțiunile producătorului. În caz contrar, se urmează procedura descrisă în continuare:

a) Se amestecă picăturile unei suspensii de anticorpi și de exudat bacterian marcate (circa 5 f2μl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor de testare cu multe godeuri;

b) Se prepară suspensii de control pozitiv și negativ din suspensii de Ralstonia solanacearum biovar 2 și dintr-o tulpina heterologă;

c) Se observă aglutinarea în probele pozitive după o omogenizare ușoară timp de 15 secunde.

4. Izolarea pe mediu selectiv

4.1. Însămânțare pe mediu selectiv

NOTĂ: Înainte de aplicarea acestei metode pentru prima dată, se efectuează teste preliminarii pentru a garanta o detecție reproductibilă a 10^3-10^4 celule formatoare de coloniu (cfu) per ml de Ralstonia solanacearum adăugată la extractele care au dat rezultate negative la testele anterioare.

Se folosește un mediu selectiv validat corespunzător, de exemplu, SMSA (modificat de Elphinstone et al., 1996; vezi apendicele 2).

De asemenea, trebuie diferențiată Ralstonia solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul respectiv. În plus, coloniile de Ralstonia solanacearum pot prezenta o morfologie atipică în cazul în care plăcile sunt suprapopulate sau în cazul în care sunt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în care se suspectează efectele de concurență sau de antagonism, proba trebuie testată din nou, utilizându-se o metodă de testare diferită.

Cea mai mare sensibilitate de detecție, în cadrul acestei metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între - 68 și - 86°C.

Se prepară, pentru control pozitiv, diluții zecimale de suspensie de 10^6 ufc/ml dintr-o tulpină virulentă biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de probele de testat.

Pentru fiecare lot de mediu selectiv proaspăt pregătit, acesta trebuie testat pentru a se vedea dacă este propice înmulțirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină.

Materialul de control se testează în același mod ca și probele.

4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare de însămânțare cu scopul de a asigura diluarea întregii populații care formează colonii de saprofite. Se însămânțează 50-100 f2μl din fiecare probă de extract și fiecare diluție.

4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate și fluide, iar după 3 zile de incubare dezvoltă o colorație roz spre roșu-sângeriu în centru, prezentând spirale sau striații interne sau verticile (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).

NOTĂ: Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice de Ralstonia solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare roșie și nefluide sau parțial fluide, fiind, prin urmare, greu de deosebit de bacteriile saprofite care formează colonii.

4.1.3. Coloniile prezumtive de Ralstonia solanacearum se purifică după însămânțare și însămânțare pe mediu nutritiv general pentru a obține colonii izolate (a se vedea apendicele 2).

4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în apă sterilă (pH 6-8, fără clor) la temperatura ambiantă la întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector corespunzător între - 68 și - 86°C sau liofilizate.

4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (vezi secțiunea VI. B) și se efectuează un test de patogenitate (vezi secțiunea VI. C).

Interpretarea rezultatelor testului de izolare pe mediu selectiv

Testul de însămânțare pe mediu selectiv este negativ atunci când după 6 zile nu sunt observate colonii bacteriene sau atunci când nu sunt observate colonii caracteristice Ralstonia solanacearum, cu condiția să nu fie suspectată o inhibiție datorată competiției sau antagonismului cu alte bacterii și în cazul controalelor pozitive să fie observate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum.

Testul de însămânțare pe mediu selectiv este pozitiv atunci când sunt observate colonii prezumtive de Ralstonia solanacearum.

4.2. Procedura de îmbogățire

A se utiliza un mediu de îmbogățire validat precum mediul nutritiv modificat Wilbrink (a se vedea apendicele 2).

Această procedură poate fi folosită pentru a crește în mod selectiv populațiile de Ralstonia solanacearum în probe și pentru a crește sensibilitatea detecției Procedura permite, de asemenea, diluarea eficientă a inhibitorilor reacției PCR (1:100). Cu toate acestea, trebuie notat faptul că îmbogățirea bacteriei Ralstonia solanacearum poate eșua din cauza concurenței sau antagonismului organismelor saprofite care sunt de multe ori îmbogățite simultan. În consecință, izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum pe medii nutritive de cultură îmbogățite poate fi dificilă. De asemenea, întrucât populațiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se pot înmulți, în cazul utilizării testului ELISA, se recomandă utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.

4.2.1. Îmbogățirea pentru PCR presupune transferul a 100 f2μl de extract de probă în 10 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogățire (apendicele 2) alicotat anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogățirea ELISA, se pot folosi proporții mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 f2μl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogățire).

4.2.2. Se incubează timp de 72 de ore între 27 și 30°C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.

4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sau PCR.

4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de îmbogățire se tratează în același mod ca și probele.

NOTĂ: În cazul în care se prevede o inhibiție a îmbogățirii bacteriei Ralstonia solanacearum din cauza populațiilor considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogățirea extractelor de probe înainte de centrifugare sau alte etape de concentrare pot determina obținerea unor rezultate mai bune.

5. Testul de imunofluorescență

Principiu

Ținându-se seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea testului de imunofluorescență ca principal test de detecție rapidă.

În cazul în care testul de imunofluorescență este utilizat ca principal test detecție rapidă și rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare, un test PCR sau un test FISH drept test secundar. În cazul în care testul de imunofluorescență este utilizat ca test secundar și rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare după cum prevede diagrama funcțională.

NOTĂ: Se utilizează o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum. europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 10^5-10^6 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescență de cel puțin 1: 2.000. La efectuarea testului, diluțiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.

Testul trebuie efectuat cu extracte de probe proaspăt preparate. După caz, se pot folosi și extracte conservate în soluție de glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68°C și -86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4), recentrifugarea timp de 15 minute la 7.000 g și resuspendarea în același volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când probele sunt fixate de lame prin flambare.

Separat se prepară lame de control pozitiv dintr-o tulpină omologă sau orice altă tulpină de referință de Ralstonia solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede apendicele 3 B, și, facultativ, în tampon.

În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeași lamă țesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între - 16 și - 24°C).

În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de extracte de probe care au dat rezultate negative la testele anterioare de detecție a bacteriei Ralstonia solanacearum.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3.

Se folosesc pentru microscop lame cu multe godeuri, având, de preferință, 10 ferestre cu diametru de cel puțin 6 mm.

Materialul de control se testează în același mod ca și probele.

5.1. Lamele-test se prepară folosindu-se una dintre următoarele metode:

(i) Extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru godeuri cu diametru mai mare) dintr-o diluție de 1/100 de sediment resuspendat în primul godeu. Apoi se pipetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele indicate în figura 1.

(îi) Pentru alte extracte concentrate:

Se pregătesc diluții zecimale (1/10, 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat și din fiecare diluție pe un rând de godeuri. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate în figura 2.

5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o temperatură de 40-45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă fie prin încălzire (15 minute la 60°C), trecere prin flacără, cu 95 % etanol sau în conformitate cu instrucțiunile specifice ale furnizorilor de antiseruri.

În cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi stocate la congelator într-o cutie uscată, atât cât este necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test.

5.3. Procedura testului de imunofluorescență

(i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i):

Se prepară un set de diluții de 1/2. În primul godeu diluția ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T).

(îi) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1(îi):

Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon IF.

Diluția de lucru are efect asupra specificității.

Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i)

Diluții ale extractului concentrat resuspendat

1/100 1/1 1/1 1/1 1/1

Diluții ale extractului

concentrat resuspendat

(T = T/2 T/4 T/2 T 2T

Diluții duble ale

titru) antiserului/anticorpilor

Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) și 5.3 (îi)

Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor

Diluție zecimală a

sedimentului resuspendat

1/1 1/10 1/100 gol gol

5.3.1. Lamele se așază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluția sau diluțiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în fiecare godeu trebuie să fie cel puțin echivalent cu volumul de extract pipetat pe lamă.

Următoarea procedură ar trebui aplicată în absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi:

5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).

5.3.3. Se îndepărtează antiserul de pe fiecare lamă și se spală lamele cu atenție cu tamponul IF. Se spală prin imersare în soluție tampon IF-Tween (apendice 4) timp de 5 minute și apoi în tampon IF. Se evită formarea de aerosoli sau transferul de picături care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hârtie de filtru.

5.3.4. Lamele se așază pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile lamelor-test cu diluții ale conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat pipetat în godeuri trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi pipetat.

5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).

5.3.6. Se îndepărtează conjugatul de pe lamă. Se spală în conformitate cu cele indicate anterior (pct. 5.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de tampon IF.

5.3.7. Se pipetează 5-10 f2μl tampon glicerol fosfat 0,1 M (apendicele 4) sau o altă soluție antidecolorare de montare comercială în fiecare godeu și se acoperă cu o lamelă.

5.4. Citirea testului de imunofluorescență

5.4.1. Se examinează lamele-test la un microscop cu sursă de lumină epifluorescentă și cu filtre adaptate pentru a lucra cu izotiocianat de fluoresceină, cu ulei de imersie sau în apă, la o mărire de 500-1.000. Se examinează godeurile pe două diametre în unghi drept și de-a lungul perimetrului. Pentru probele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel puțin 40 câmpuri microscopice.

Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente și colorate complet la titrul de anticorpi sau la diluția de lucru determinată. Testul IF (pct. 5) trebuie repetat în cazul în care apare o colorație anormală.

5.4.2. Se caută prezența celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeași diluție de anticorpi. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare.

În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

5.4.3. Există un anumit număr de probleme care afectează specificitatea testului de imunofluorescență. La nivelul conurilor de țesut vascular și în bucățile de tulpini pot apărea populații de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum și bacterii saprofite care pot conduce la reacții încrucișate, având mărime și morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum.

5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune și morfologie sunt caracteristice titrului sau diluției de lucru a anticorpilor menționați la pct. 5.3.

5.4.5. Interpretarea testului IF:

(i) În cazul în care se observă celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 5).

Testul de imunofluorescență se consideră ca fiind pozitiv pentru probele care conțin cel puțin 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind potențial contaminată, fiind necesare mai multe testări.

(îi) Testul de imunofluorescență se consideră ca fiind negativ pentru probele care conțin mai puțin de 5 x 10^3 celule pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind negativă, efectuarea altor teste nefiind obligatorie.

6. Testele PCR

Principii

În cazul în care testul PCR se folosește drept test principal de detecție, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test de imunofluorescență drept al doilea test de detecție obligatoriu. În cazul în care testul PCR se folosește ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnoza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcțională.

O exploatare completă a acestei metode ca test principal de detecție se recomandă numai atunci când se dobândește o expertiză specializată în domeniu.

NOTĂ: Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detecția reproductibilă a 10^3-10^4 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obține niveluri maxime de sensibilitate și de specificitate.

Se folosesc reactivi și protocoale PCR validate (vezi apendice 6). Se alege, de preferință, o metodă care să conțină un control intern.

Se iau măsurile de precauție necesare pentru a se evita contaminarea probei cu ADN-țintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentați în laboratoare de biologie moleculară specializate, pentru a se reduce cât mai mult posibilitatea contaminării cu ADN-țintă.

Controalele negative (pentru procedurile de extracție de ADN și amplificare PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a indica o eventuală apariție a unui transfer de ADN.

Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR:

- extractul probei care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea Ralstonia solanacearum;

- tampoanele utilizate pentru extracția ADN din probă;

- amestecul de reactivi pentru PCR.

Următoarele controale pozitive ar trebui incluse:

- alicote de sedimente resuspendate la care s-a adăugat Ralstonia solanacearum (preparare: vezi apendice 3 B);

- suspensie de 10^6 celule pe ml dintr-un izolat virulent de Ralstonia solanacearum în apă (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendice 3 B);

- atunci când este posibil, se folosește, de asemenea, în testul PCR, ADN extras din probe pozitive în testul PCR.

Pentru a se evita o eventuală contaminare, controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al probelor de testat.

Extractele probelor trebuie curățate, atât cât este posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci când se prevede utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare extracte de tuberculi de cartofi spălați.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt prevăzute în apendicele 3.

6.1. Metode de purificare a ADN-ului

Se folosesc controale pozitive și negative în conformitate cu metoda descrisă anterior (vezi apendicele 3).

Controalele se testează în același mod cu probele.

Există o serie de metode de purificare a ADN-țintă din substraturile de probe complexe, ce permit eliminarea inhibitorilor PCR și a altor reacții enzimatice și concentrează ADN-ul țintă din probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6.

a) Metoda Pastrik (2000)

(1) Se pipetează 220 f2μl de tampon de liză [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml.

(2) Se adaugă 100 f2μl de extract de probă și se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de apă la 95°C timp de 10 minute.

(3) Se așază tubul pe gheață timp de 5 minute.

(4) Se adaugă 80 f2μl de soluție concentrată de lizozim (50 mg de lizozim pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) și se incubează la 37°C timp de 30 de minute.

(5) Se adaugă 220 f2μl de soluție A de Easy DNA(r) (Invitrogen), se amestecă bine prin vortexare și se incubează la 65°C timp de 30 de minute.

(6) Se adaugă 100 f2μl de soluție B de Easy DNA(r) (Invitrogen), se omogenizează bine prin vortexare până când precipitatul circulă liber în tub, iar proba are o consistență uniform-vâscoasă.

(7) Se adaugă 500 f2μl de cloroform și se omogenizează prin vortexare până când vâscozitatea este redusă și amestecul este omogen.

(8) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C pentru a separa fazele și a forma interfaza.

(9) Faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf.

(10) Se adaugă 1 ml de etanol 100 % (- 20°C), se omogenizează scurt prin vortexare și se incubează pe gheață timp de 10 minute.

(11) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C și se îndepărtează etanolul din extractul concentrat.

(12) Se adaugă 500 f2μl de etanol 80 % (- 20°C) și se amestecă prin răsturnare.

(13) Se centrifughează la 15.000 g timp de 10 minute la 4°C, se păstrează sedimentul și se îndepărtează etanolul.

(14) Sedimentul se lasă să se usuce în aer liber sau într-un SpeedVac ADN.

(15) Sedimentul se repune în suspensie în 100 f2μl de apă ultrapură sterilă și se lasă la temperatura ambiantă timp de cel puțin 20 de minute.

(16) Se depozitează la - 20°C până când extractul este necesar pentru PCR.

(17) Înainte de utilizare se centrifughează, pentru reacția de amplificare prin PCR fiind necesari 5 f2μl de supernatant conținând ADN.

b) Alte metode

Pot fi utilizate și alte metode de extracție a ADN, de exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit, cu condiția ca acestea să aibă o eficacitate echivalentă de purificare a ADN-ului din controalele pozitive cu un conținut de 10^3-10^4 celule patogene per ml.

6.2. Amplificare PCR

6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN de testat și controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct. 6). Se prepară o diluție decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat în conformitate cu protocoalele publicate (apendice 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR multiplex care include un control intern al reacției PCR.

6.2.3. Se adaugă 2-5 f2μl de extract de ADN pe 25 μl mix PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (vezi apendicele 6).

6.2.4. Se include un control negativ conținând numai mix de amplificare și se adaugă apă ultrapură, din aceeași sursă cu cea utilizată pentru mixul de amplificare PCR, în locul probei.

6.2.5. Tuburile se introduc în același termociclor utilizat la testul preliminar și se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (apendice 6).

6.3. Analiza produsului reacției PCR (amplicon)

6.3.1. Fragmentele PCR sunt detectate prin electroforeză în gel de agaroză. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puțin 12 f2μl de ADN amplificat din fiecare probă la care se adaugă 3 f2μl de tampon de încărcare (apendice 6) în gel de agaroză 2 % într-un tampon tris-acetat-EDTA (TAE) (vezi apendicele 6). Se folosește un marker de ADN corespunzător mărimii așteptate a ampliconului, precum cel de 100 bp.

6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (l0,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luându-se măsurile de precauție necesare pentru manipularea acestui agent mutagen.

6.3.3. În cazul unor produse PCR având mărimea așteptată (vezi apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (? = 302 nm) și se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR, efectuându-se o analiză de restricție enzimatică pe o probă de ADN amplificată rămasă. În acest scop, ADN-ul amplificat rămas se incubează la o temperatură optimă și pe o perioadă optimă cu o enzimă și un tampon corespunzător (vezi apendicele 6). Fragmentele restrictate se detectează prin electroforeză în gel de agaroză și colorare cu bromură de etidiu în conformitate cu metoda descrisă anterior. Dispunerea tipică a fragmentelor după analiza de restricție enzimatică se vizualizează prin iluminare ultravioletă. Fragmentele de ADN se compară cu tulpinile de control pozitiv înainte și după restricție.

Interpretarea rezultatului testului PCR

Testul PCR este negativ atunci când produsul PCR specific pentru Ralstonia solanacearum cu dimensiunea așteptată nu este detectat pentru proba respectivă, iar pentru ansamblul de probe, în cazul unui multiplex PCR cu primeri de control intern specific plantei, un al doilea produs PCR cu dimensiunea așteptată trebuie să fie amplificat cu probele respective.

Testul PCR este pozitiv în cazul în care produsul PCR caracteristic de Ralstonia solanacearum de dimensiunea și tipul de restricție (atunci când este restrictat) așteptate este detectat, cu condiția să nu existe amplificare la probele de control negativ. Se poate obține o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (apendicele 6).

NOTĂ: Se poate suspecta o inhibiție a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obținut în cazul controlului pozitiv de Ralstonia solanacearum în apă, dar se obțin rezultate negative în cazul controalelor pozitive conținând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiția reacției atunci când nu se obține niciunul dintre cele două fragmente amplificate.

Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obținut din unul sau mai multe controale negative.

7. Testul FISH

Principiu

În cazul în care testul FISH se folosește drept test principal de detecție și rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de detecție. În cazul în care testul IF se folosește ca test secundar și rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcțională.

NOTĂ: Se folosesc oligosonde validate specifice pentru Ralstonia solanacearum (a se vedea apendicele 7). Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecție reproductibilă de 10^3-10^4 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative.

Este de preferat să se aplice procedura descrisă în continuare extractelor de probe proaspăt preparate, dar se pot folosi și extracte de probe conservate la temperaturi cuprinse între - 16°C și - 24°C sau între - 68°C și - 86°C.

Drept control negativ, se folosesc alicote de extracte de probe care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a Ralstonia solanacearum.

Drept control pozitiv, se folosesc suspensii conținând 10^5-10^6 celule pe ml de Ralstonia solanacearum biovar 2 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) preparate în tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Separat, se prepară lame de control pozitiv din tulpina omologă sau din orice altă tulpină de referință de Ralstonia solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3 B.

Controlul procesului de hibridizare se realizează prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) care colorează toate eubacteriile prezente în probă.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3 A.

Materialul de control se testează în același mod ca și probele.

7.1. Fixarea extractului de cartof

Protocolul descris în continuare se bazează pe Wullings et al. (1998):

7.1.1. Se prepară soluția de fixare (a se vedea apendicele 7).

7.1.2. Se pipetează 100 f2μl din fiecare extract de probă într-un tub Eppendorf și se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g.

7.1.3. Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 200 f2μl de soluție de fixare preparată cu mai puțin de 24 de ore înainte. Se omogenizează prin vortexare și se incubează timp de o oră în frigider.

7.1.4. Se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g, se îndepărtează supranatantul, iar sedimentul se resuspendă în 75 f2μl de PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7).

7.1.5. Se pipetează 16 f2μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se pipetează două probe diferite, nediluate, și 10 f2μl diluție de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul suspensiei (49 f2μl) poate fi conservată la - 20°C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare și se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (omogenizați prin vortexare).

Figura 7.1. Configurația unei lame pentru testul FISH

7.1.6. Se usucă lamele la temperatura ambiantă (sau într-un uscător, la 37°C), apoi se fixează prin flambare.

Procedura de hibridizare poate fi întreruptă în acest stadiu și continuată a doua zi. Lamele trebuie păstrate într-un loc uscat, la temperatura ambiantă, ferite de praf.

7.2. Hibridizare

7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol de 50 %, 80 % și 96 %, cu o durată de un minut fiecare. Se aranjează lamele pe un suport și se lasă la uscat la temperatura ambiantă.

7.2.2. Se realizează o cameră de incubare umedă căptușind fundul unei cutii ermetice cu hârtie absorbantă sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea apendicele 7). Cutia se preincubează timp de cel puțin 10 minute în incubatorul de hibridizare la o temperatură de 45°C.

7.2.3. Se pipetează 10 f2μl de soluție de hibridizare (apendicele 7) în 8 godeuri (godeuri 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 și 10; vezi figura 7.1) ale fiecărei lame, lăsând goale cele două godeuri din mijloc (3 și 8).

7.2.4. Se acoperă cu lamele (24 x 24 mm) primul și ultimele 4 godeuri, având grijă să nu prindă aer sub ele. Lamele se introduc în camera umedă încălzită în prealabil și se lasă timp de 5 ore în incubator la 45°C la întuneric, pentru hibridizare.

7.2.5. Se pregătesc 3 recipiente conținând 1 l de apă Milli Q (biologie moleculară), 1 l de hibmix 1X în 334 ml de hibmix 3X și 666 ml de apă Milli Q (biologie moleculară) și1 l de hibmix 1/8X în 42 ml de hibmix 3X și 958 ml de apă Milli Q (biologie moleculară). Se preincubează fiecare recipient în baie de apă la 45°C.

7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame și se așază pe un suport de lame.

7.2.7. Se elimină excesul de probă prin incubare timp de 15 minute la 45°C în recipientul cu hibmix 1X.

7.2.8. Se transferă suportul cu lame într-o soluție de spălare cu hibmix 1/8X și se lasă la incubat timp de încă 15 minute.

7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă Milli Q și se așază pe o hârtie de filtru. Se îndepărtează umiditatea în exces tamponând ușor suprafața umedă cu hârtie de filtru. Se pipetează în fiecare godeu 5-10 f2μl de soluție antidecolorare (de exemplu, Vectashield produs de Vecta Laboratories CA, USA, sau altă soluție echivalentă) și se acoperă întreaga suprafață a lamei cu o lamelă (24 x 60 mm).

7.3. Citirea testului FISH

7.3.1. Lamele se examinează imediat cu ajutorul unui microscop cu epifluorescență, cu obiectivul de imersie, în ulei de imersie la o mărire de 630 x 1.000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene prezente în probe (inclusiv majoritatea celulelor Gram-negative) apar colorate în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de Ralstonia solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în roșu fluorescent. Se compară morfologia celulelor din probe cu cea a celulelor din controlul pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet și intens fluorescente. Testul FISH (pct. 7) trebuie repetat în cazul în care apare o colorație anormală. Godeurile se examinează de-a lungul a două diametre perpendiculare și în jurul perimetrului. Pentru probele care nu conțin celule sau conțin un număr mic de celule, se examinează cel puțin 40 de câmpuri microscopice.

7.3.2. Se observă prezența celulelor intens fluorescente, cu o morfologie tipică de Ralstonia solanacearum în ferestrele de test ale lamelor (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv sau mai bună. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare.

7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Aceasta se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

7.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente care afectează specificitatea testului FISH. La nivelul conurilor de țesut vascular și tulpinii pot apare populații de celule fluorescente cu morfologie atipică și populații de bacterii saprofite care dau reacții încrucișate, având dimensiuni și morfologii asemănătoare cu celulele de Ralstonia solanacearum, însă într-o proporție mult mai mică decât în cazul testului IF.

7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente cu dimensiune și morfologie tipice.

7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH:

(i) Testul FISH este valid atunci când celulele intens fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni și morfologie tipice pentru Ralstonia solanacearum, sunt vizibile cu ajutorul filtrului FITC și celulele intens fluorescente de culoare roșie sunt vizibile folosindu-se filtrul cu rodamină în toate controalele pozitive, iar în controlul negativ nu se observă nicio celulă. În cazul în care proba conține celule intens fluorescente, cu o morfologie tipică, se estimează numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 4). Probele ce conțin cel puțin 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat se consideră ca fiind potențial infectate și se recomandă continuarea testelor. Probele ce conțin mai puțin de 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat sunt considerate ca fiind negative.

(îi) Testul FISH este negativ în cazul în care celulele intens fluorescente de culoare roșie, având dimensiuni și morfologie caracteristice pentru Ralstonia solanacearum, nu se observă cu ajutorul filtrului cu rodamină, cu condiția ca celulele intens fluorescente de culoare roșie să fie vizibile în lamele de control pozitiv folosindu-se filtrul cu rodamină.

8. Testele ELISA

Principiu

Testul ELISA nu poate fi utilizat ca test secundar pe lângă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilității sale relativ slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogățirea probelor și utilizarea anticorpilor monoclonali sunt obligatorii (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/ Home/main). Îmbogățirea probelor înainte de efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru creșterea sensibilității acestuia, dar poate să inhibe testul din cauza competiției cu alte organisme prezente în probă.

NOTĂ: Se folosește o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 10^5-10^6 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se conjugate corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu recomandările producătorului. La efectuarea testului, diluția de lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală cu cea a titrului formulei comerciale.

Se determină titrul anticorpilor pentru o suspensie de 10^5-10^6 celule/ml dintr-o tulpină omologă de Ralstonia solanacearum.

Drept controale negative se utilizează un extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru Ralstonia solanacearum și o suspensie bacteriană preparată în tampon fosfat care nu provoacă reacții încrucișate

Drept control pozitiv se folosesc extracte de probe care au dat anterior rezultate negative, la care s-a adăugat 10^3-10^4 celule/ml de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicii 2 A și B). Pentru a compara rezultatele din fiecare placă se folosește o suspensie standard de 10^5-10^6 celule/ml în PBS de Ralstonia solanacearum. Controalele pozitive trebuie să fie pipetate cu grijă pe placa de microtitrare, separat de proba sau probele care fac obiectul testului.

Materialele de control pozitiv și negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt enumerate în apendicele 3 A.

Materialul de control se testează în același mod cu probele.

Au fost validate două protocoale ELISA:

a) ELISA indirect (Robinson-Smith et al., 1995)

(1) Se folosesc alicote de 100-200 f2μl de sediment resuspendat. (Pentru a reduce rezultatele nespecifice se încălzesc timp de 4 minute la 100°C pe baie de apă sau într-un bloc de încălzire.)

(2) Se adaugă un volum egal de tampon 2X (apendicele 4) și se omogenizează prin vortexare.

(3) Se pipetează alicote de 100 f2μl de extract în cel puțin două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37°C sau peste noapte la 4°C.

(4) Se îndepărtează extractele din godeuri. Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare în godeuri cel puțin 5 minute.

(5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-Ralstonia solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul).

(6) Se pipetează100 f2μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37°C.

(7) Se îndepărtează soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].

(8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat secundar de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație Se pipetează100 f2μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37°C.

(9) Se îndepărtează conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)].

(10) Se pipetează 100 f2μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

b) DAS-ELISA

(1) Se prepară diluția corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-Ralstonia solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 f2μl în fiecare godeu. Se incubează timp de 4-5 ore la 37°C sau timp de 16 ore la 4°C.

(2) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

Se adaugă 190 f2μl de extract de probă în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă controlul pozitiv și negativ în câte două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de 16 ore la 4°C.

(3) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici Ralstonia solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) și se pipetează 190 f2μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C.

(5) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 f2μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C.

(7) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).

(8) Se prepară o soluție de substrat de fosfatază alcalină conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de soluție tampon (apendicele 4). Se adaugă 200 f2μl în fiecare godeu. Se incubează la întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

Interpretarea rezultatelor testelor ELISA

Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mică decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiția ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare de 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) și de două ori mai mare decât densitatea optică obținută pentru controlul negativ.

Testul ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mare decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiția ca DO pentru toate godeurile de control negativ să fie mai mică decât de două ori DO obținută pentru godeurile de control pozitiv.

O citire negativă a testului ELISA în godeurile de control pozitiv indică faptul că testul nu a fost efectuat corect sau că a fost inhibat. O citire pozitivă a testului ELISA în godeurile de control negativ indică o contaminare încrucișată sau o reacție nespecifică.

9. Testul biologic

NOTĂ: Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecție reproductibilă a 10^3-10^4 celule formatoare de colonii (UFC) per ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative (preparare: vezi apendice 3).

Sensibilitatea cea mai mare de detecție poate fi atinsă atunci când se folosesc extracte de probe proaspăt preparate și în condiții optime de creștere. Cu toate acestea, metoda se poate aplica cu succes extractelor păstrate în glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68 și - 86°C.

Următorul protocol se bazează pe protocolul Janse (1988):

9.1. Pentru fiecare probă se utilizează 10 plante-test ale unui soi (cultivar) de tomate sensibil (de exemplu, Moneymaker sau un cultivar cu o sensibilitate echivalentă stabilită în laboratorul de testare) în stadiul celei de-a treia frunze adevărate. Pentru detalii privind cultura, vezi apendicele 8. De asemenea, se pot utiliza vinete (de exemplu, Black Beauty sau cultivări cu o sensibilitate echivalentă), folosindu-se numai plante în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Cu toate acestea, s-a constatat că la plantele de vinete simptomele sunt mai puțin severe și se dezvoltă mai încet. Prin urmare, atunci când este posibil, se recomandă utilizarea plantulelor de tomate.

9.2. Se inoculează 100 f2μl de extract în fiecare plantă-test.

9.2.1. Inoculare prin injectare

Plantele-test se inoculează în tulpină chiar deasupra cotiledoanelor cu ajutorul unei seringi cu ac hipodermic (minimum 23G).

9.2.2. Inoculare prin incizie

Se ține planta între două degete și se pipetează pe tulpină, între cotiledoane și prima frunză, o picătură (circa 5-10 f2μl) de extract de probă.

Cu ajutorul unui bisturiu steril, plecând de la picătura de extract, se face o incizie diagonală pe o lungime de 1 cm și cu o adâncime egală cu aproximativ două treimi din grosimea tulpinii.

Se închide incizia aplicând vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi.

9.3. Prin aceeași tehnică se inoculează 5 plantule cu o suspensie apoasă de 10^5-10^6 celule per ml dintr-o cultură virulentă de 48 de ore de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv și 5 plantule cu tampon fosfat (apendice 4) drept control negativ. Se separă plantele control pozitiv și negativ de celelalte plante pentru a se evita contaminările încrucișate.

9.4. Plantele test se cresc în încăperi de carantină până la 4 săptămâni la temperatura de 25-30°C și umiditate relativ mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a se evita contaminarea, plantele control pozitiv și negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori cameră de cultivare sau, în cazul în care spațiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele aparținând unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precauție pentru a se evita o contaminare încrucișată. Este esențial ca în serele și camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.

Se observă apariția simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză și/sau pipernicire.

9.5. Se izolează plantele infectate și se identifică culturile purificate prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum (lit. B).

9.6. În cazul în care nu se observă niciun simptom după 3 săptămâni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare pe o probă formată din bucăți de tulpină de 1 cm prelevate de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează însămânțarea pe mediu de cultură (pct. 4.1).

9.7. Se identifică toate culturile purificate prezumtive de Ralstonia solanacearum (lit. B).

Interpretarea rezultatelor testului biologic:

Rezultatele testului biologic sunt valide atunci când plantele control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi reizolate din aceste plante și nu se observă niciun simptom la plantele control negativ.

Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test inoculate cu extract de probă nu sunt infectate cu Ralstonia solanacearum și cu condiția ca Ralstonia solanacearum să fie detectată în plantele control pozitiv.

Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum.

B. TESTE DE IDENTIFICARE

Culturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se identifică prin cel puțin unul dintre următoarele teste bazate pe principii biologice diferite.

Se includ, după caz, tulpini de referință cunoscute, pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).

1. Teste de identificare enzimatice și de nutriție

Se stabilesc următoarele caracteristici fenotipice prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în conformitate cu metodele descrise de Lelliott și Stead (1987), Klement et al. (1990) și Schaad (2001).

Test

Rezultat preconizat

Producția de pigmenți fluorescenți

-

Incluziuni de poli-beta-hidroxibutirat

+

Test de oxidare/fermentare (O/F)

O+/F-

Activitatea catalazei

+

Testul oxidazei de Kovac

+

Reducerea nitratului

+

Utilizarea citratului

+

Creștere la 40°C

-

Creștere în 1% NaCl

+

Creștere în 2% NaCl

-

Activitatea arginin dihidrolazei

-

Lichefierea gelatinei

-

Hidroliza amidonului

-

Hidroliza esculinei

-

Producție de levan

-

2. Testul IF

2.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în tampon IF (apendice 4).

2.2. Se prepară o serie de diluții de 1/2 dintr-un antiser corespunzător (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/ irc/sanco/Home/main).

2.3. Se aplică procedura testului IF (lit. A pct. 5).

2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obținut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv.

3. Testul ELISA

NOTĂ: În cazul în care se efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează alte teste serologice pe lângă această metodă.

3.1. Se prepară o suspensie de circa 10^8 celule/ml în PBS 1X (vezi apendicele 4).

3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.

3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică a culturii este egală cel puțin cu 1/2 din densitatea optică obținută pentru controlul pozitiv.

4. Testul reacției de polimerizare în lanț (PCR)

4.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă sterilă ultrapură.

4.2. Se pipetează 100 f2μl din suspensie în tuburi închise și se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o temperatură situată între - 16 și - 24°C până în momentul în care sunt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.

4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia solanacearum se obține atunci când fragmentele amplificate prin PCR au aceeași dimensiune și aceleași polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricție cu cele ale tulpinii de control pozitiv.

5. Testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)

5.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă ultrapură.

5.2. Se aplică procedura FISH (lit. A pct. 7) folosindu-se cel puțin două oligosonde specifice pentru Ralstonia solanacearum (apendice 7).

5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura trebuie să prezinte aceleași reacții ca și controlul pozitiv.

6. Profilul acizilor grași (FAP)

6.1. Se realizează o cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).

6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. Prezența acizilor grași caracteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH și 18:1 2OH și absența16:0 3OH indică prezența Ralstonia sp.

7. Metode de caracterizare a tulpinii

Se recomandă o caracterizare a tulpinii prin una dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia solanacearum.

Se includ, după caz, tulpini de referință cunoscute pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).

7.1. Determinarea biovarului

Există diferite biovaruri de Ralstonia solanacearum în funcție de capacitatea lor de a utiliza și/sau oxida 3 zaharuri și 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 și Hayward et al., 1990). Mediile de creștere pentru testul biovarului sunt descrise în apendicele 2. Testul poate fi realizat inoculând prin injectare profundă a mediilor cu culturi pure de izolat de Ralstonia solanacearum și incubare la 28°C. În cazul în care mediile sunt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri sterile (200 f2μl/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72 de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al testului.

Biovar

1

2

3

4

5

Utilizarea:

Maltozei

-

+

+

-

+

Lactozei

-

+

+

-

+

D (+) Celobiozei

-

+

+

-

+

Manitolului

-

-

+

+

+

Sorbitolului

-

-

+

+

-

Dulcitolului

-

-

+

+

-

Teste suplimentare diferențiază biovarul 2 în subfenotipuri:

Biovar 2A (răspândit în lume)

Biovar 2A (găsit în Chile și în Columbia)

Biovar 2T (găsit în zona tropicală)

Utilizarea trehalozei

-

+

+

Utilizarea mezo-inozitei

+

-

+

Utilizarea D-ribozei

-

-

+

Activitate pectolitică1)

scăzută

scăzută

ridicată

1) Vezi Lelliott & Stead (1987)

7.2. Amprentare genomică

Diferențierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin:

7.2.1. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție (RFLP) (Cook et al., 1989);

7.2.2. PCR realizat pe secvențe repetitive folosindu-se primeri REP, BOX și ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995);

7.2.3. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție amplificate (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. metodele PCR.

Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; vezi apendice 6) pentru a diferenția tulpinile aparținând diviziunii 1 (biovari 3, 4 și 5) și diviziunii 2 (biovari 1, 2A și 2T) ale Ralstonia solanacearum, definite inițial de analiza RFLP (Cook et al., 1989) și analiza secvenței 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).

C. TEST DE CONFIRMARE

Testul de patogenitate trebuie efectuat pentru confirmarea finală a diagnosticului și pentru evaluarea virulenței culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum.

(1) Se prepară un inoculum de circa 10^6 celule/ml dintr-o cultură de 24-48 de ore dintr-o tulpină corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicele 3).

(2) Se inoculează 5-10 plantule de tomate sau vinete sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (vezi lit. A pct. 9).

(3) Se incubează până la două săptămâni la 25-28°C și umiditate relativă crescută, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absența simptomelor la sfârșitul acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Ralstonia solanacearum.

(4) Se observă apariția simptomelor de ofilire și/sau epinastie, cloroză și de pipernicire.

(5) Se izolează plantele simptomatice îndepărtând o secțiune de țesut din tulpină la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunțește și se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM (apendice 4). Se însămânțează suspensia pe un mediu adecvat, de preferință mediu selectiv (apendice 2), se incubează timp de 48-72 de ore la 28°C și se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum.

Apendicele 1

Laboratoarele care efectuează optimizarea și validarea protocoalelor

Laborator1)

Oraș

Țara

Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit

Viena și Linz

Austria

Departament Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Danemarca

Central Science Laboratory

York

Anglia

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Scoția

Laboratoire national de la protection des vegetaux, Unite de Bacteriologie

Angers

Franța

Laboratoire national de la protection des vegetaux, Station de quarantine de la pomme de terre

Le Rheu

Franța

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Germania

Pflanzenschutzamt Hannover

Hanovra

Germania

State Laboratory

Dublin

Irlanda

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Italia

Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Italia

Nederlandse Algemene Keuringesdienst

Emmeloord

Țările de Jos

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Țările de Jos

Direccao-Geral de Proteccao das Culturas

Lisabona

Portugalia

Centro de Diagnostico de Aldearrubia

Salamanca

Spania

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Spania

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Suedia

1) Experți de contact: vezi http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apendicele 2

Medii pentru izolarea și cultivarea bacteriei Ralstonia solanacearum

a) Medii de creștere în general

Agar nutritiv (AN)

Agar nutritiv (Difco)

23,0 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Drojdie - peptonă - glucoză-agar (YPGA)

Extract de levură (Difco)

5,0 g

Bacto-peptonă (Difco)

5,0 g

D (+) glucoză (monohidrat)

10,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Zaharoză - peptonă - agar (SPA)

Zaharoză

20,0 g

Bacto-peptonă (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4▪7H2O

0,25 g

Bacto-geloză (Difco)

15,0 g

Apă distilată

1,0 l

pH 7,2-7,4

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Mediul tetrazoliu Kelman

Acizi casiminici (Difco)

1,0 g

Bacto-peptonă (Difco)

10,0 g

Dextroză

5,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Se răcește la 50°C și se adaugă o soluție apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obținerea unei concentrații finale de 50 mg la litru.

b) Medii de creștere selective validate

Mediu SMSA (Englebrecht, 1994, modificat de Elphinstone et al., 1996)

Mediu de bază

Acizi casiminici (Difco)

1,0 g

Bacto-peptonă (Difco)

10,0 g

Glicerol

5,0 ml

Bacto-agar (Difco) (vezi nota 2)

15,0 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Se răcește la 50°C și se adaugă soluții apoase concentrate, sterilizate prin filtrare, conținând următoarele ingrediente pentru obținerea concentrațiilor finale specificate:

Cristal violet (Sigma)

5 mg la litru

Sulfat de polimixină B (Sigma P-1004)

600.000 unități (circa 100 mg) la litru

Bacitracină (Sigma B-0125)

1.250 unități (circa 25 mg) la litru

Cloramfenicol (Sigma C-3175)

5 mg la litru

Penicilină-G (Sigma P-3032)

825 unități (circa 0,5 mg) la litru

Clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma)

50 mg la litru

Observații:

1. Utilizarea altor reactivi decât cei menționați anterior poate afecta creșterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

2. Agarul de tip oxoid nr. 1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz, creșterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar și creșterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea, redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum poate dura o zi sau două în plus, iar colorația roșie poate fi mai puțin pronunțată decât pe mediu de Bacto-agar.

3. O creștere a concentrației de bacitracină la 2.500 de unități la litru poate reduce populațiile de bacterii concurente fără a perturba creșterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

Mediile și soluțiile concentrate de antibiotice se păstrează la 4°C la întuneric și timp de maximum o lună.

Trebuie asigurată absența condensului pe suprafața plăcilor înainte de utilizare.

A se evita uscarea excesivă a plăcilor.

După prepararea fiecărui lot nou de mediu de cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însămânțarea unei suspensii dintr-o cultură de referință de Ralstonia solanacearum (vezi apendicele 3) și se observă formarea de colonii tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile.

c) Medii de îmbogățire validate

Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Se prepară ca și pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină Bacto-agar și clorura de 2-3-5-tetrazoliu.

Mediu nutritiv modificat Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Zaharoză

10 g

Proteoză peptonă

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Apă distilată

1 l

Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute și se răcește la 50°C.

Se adaugă soluții concentrate de antibiotice ca și pentru mediul nutritiv SMSA.

Apendicele 3

A. Material de control standardizat disponibil în comerț

a) Tulpini bacteriene

Următoarele tulpini bacteriene se recomandă spre utilizare în calitate de material standard de referință sau control pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita reacțiile încrucișate (tabelul 2). Toate tulpinile sunt disponibile în comerț la următoarele adrese:

1. Național Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;

2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Țările de Jos;

3. Collection francaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA - Station de phytobacteriologie, Angers, Franța.

Tabelul 1. Tulpini de referință SMT de Ralstonia solanacearum

Cod NCPPB

SMT diez

Alte coduri

Țara de origine

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS 11

Egipt

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS 21

Turcia

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS 26

Anglia

2

NCPPB1584

23

CFBP 4598, EURS 49

Cipru

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS 50

Suedia

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601,502, EURS 55

Belgia

2

NCPPB 4156(*)

71 (*)

PD 2762, CFBP 3857

Țările de Jos

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15,59

Franța

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port448, EURS 80, NCPPB 4066

Portugalia

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Spania

2

NCPPB 4161

76

B3B

Germania

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL 60-1, R 842

Statele Unite

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP 310, SEQ 205

Columbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R 578, CIP 312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R 568, CIP 226

Brazilia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R 276/355, CIP 72, SEQ 225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R 280/363, CIP 49, HAY 0131a

Australia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R 297/ 349, CIP 121, CMIb 2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipine

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, Hemps 2

China

5

_______

Tabelul 2. Tulpini de referință SMT corelate serologic sau genetic în vederea utilizării pentru optimizarea testelor de detecție

Cod NCPPB

SMT diez

Alt cod

Identificare

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa1)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. Marginalis1)

NCPPB 4164

-

CFBP 2227

Burkholderia cepacia2)

NCPPB 4165

-

CFBP 2459

Ralstonia pickettii2)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567 CSL Pr 1150

Ralstonia pickettii1)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618 PD 2778

Ralstonia sp1)

NCPPB 1127

53

CFBP3575

Burkholderia andropogonis1)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli1)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia1)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae1)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii1)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium1),2), 3)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619 IPO S339

Enterobacter sp1)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp1)

NCPPB4170

63

CFBP 4621 IPO S306

Ochrobactrum anthropi1), 2)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622 IPO 1693

Curtobacterium sp1),2)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp1)

NCPPB 4173

-

PD 2318

Aureobacteriu sp2)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp.1),2)

_________

1) Tulpină care poate determina în testele serologice (IF și/sau ELISA) o reacție încrucișată cu antiserurile policlonale.

2) Tulpină din care poate fi amplificat produsul PCR în anumite laboratoare, având dimensiuni asemănătoare celor preconizate la utilizarea primerilor specifici OLI-1 și Y-2 (vezi apendicele 6).

3) Poate determina o reacție încrucișată în majoritatea testelor, dar cunoscut ca fiind prezent numai pe banan în Indonezia.

b) Material de control standardizat disponibil în comerț

Următorul material de control standardizat este disponibil în colecția de culturi NCPPB:

- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartof sănătoși în calitate de control negativ pentru ansamblul testelor;

- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartofi sănătoși conținând 10^3-10^4 și 10^4-10^6 celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele serologice și testul PCR. Întrucât liofilizarea afectează viabilitatea celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de izolare sau testele biologice;

- suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentrație 10^6 celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.

B. Pregătirea controalelor pozitive și negative pentru testele rapide de detecție PCR/ F și FISH efectuate pe conuri de cartof

Se realizează o cultură de 48 de ore dintr-o tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSA și se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obține o densitate celulară de circa 2 x 10^8 ufc/ml. În general, aceasta se obține printr-o suspensie ușor tulbure echivalentă cu o densitate optică de 0,15-600 nm.

Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof, varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia solanacearum.

Conurile se tratează după metoda obișnuită și se resuspendă sedimentul în 10 ml.

Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900 f2μl de sediment resuspendat.

Se transferă 100 f2μl din suspensia de Ralstonia solanacearum în prima microfiolă și se omogenizează prin vortexare.

Se realizează diluții zecimale în următoarele 5 microfiole.

Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.

Se prepară alicote de 100 f2μl în microfiole sterile de 1,5 ml pentru a obține 9 replici din fiecare control. Se conservă la - 16 și - 24°C până la utilizare.

Prezența și concentrația de celule de Ralstonia solanacearum în control trebuie confirmate în primul rând prin IF.

Pentru testul PCR, se efectuează o extracție de ADN din controale pozitive și negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF și FISH, se efectuează teste asupra controalelor pozitive și negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF și FISH, nivelul de detecție al celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel puțin 10^6 și 10^4 celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ să nu fie detectate.

Apendicele 4

Tampoane pentru procedura de testare

Generalități: tampoanele sterilizate nedeschise pot fi păstrate până la un an.

1. Soluții-tampon pentru procedura de extracție

1.1. Tampon de extracție (50 mM tampon fosfat, pH 7,0)

Acest tampon este utilizat pentru extracția bacteriei din țesuturile plantei prin omogenizare sau agitare.

Na2HPO4

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Apă distilată

1, 00 l

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul și se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Utilizarea următorilor compuși suplimentari poate fi utilă:

Utilizare

Cantitate (la l)

Fulgi de Lubrol

Peptizant(*)

0,5 g

Silicon antispumant DC

Agent antispumant(*)

1,0 ml

Pirofosfat tetrasodic

Antioxidant

1,0 g

Polivinilpirolidonă-40000 (PVP-40)

Legarea inhibitorilor PCR

50 g

_________

(*) A se utiliza cu metoda de extracție prin omogenizare.

1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat, pH 7,2)

Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea și diluția extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a concentrării prin centrifugare.

Na2HPO4 ▪ 12H2O

2,7 g

NaH2PO4 ▪ 2H2O

0,4 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

2. Soluții-tampon pentru testul de imunofluorescență

2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2

Acest tampon este utilizat pentru diluția anticorpilor.

Na2HPO4 ▪ 12H2O

2,7 g

NaH2PO4 ▪ 2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Apă distilată

1,0 l

Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

2.2. Tampon IF-Tween

Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor.

Se adaugă 0,1 % Tween 20 la tamponul IF.

2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6

Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru mărirea fluorescenței.

Na2HPO4 ▪ 12H2O

3,2 g

NaH2PO4 ▪ 2H2O

0,15 g

Glicerol

50 ml

Apă distilată

100 ml

În comerț sunt disponibile soluții-suport antidecolorare, de exemplu, Vectashield(R) (Vector Laboratories) sau Citifluor(R) (Leica).

3. Soluții tampon pentru testul ELISA indirect

3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Apă distilată

1,00 l

Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2 %) ca antioxidant pentru a împiedica constituirea de compuși aromatici oxidați.

3.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4

NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4 ▪ 12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Apă distilată

1,0 l

3.3. PBS-Tween

10 x PBS

100 ml

10% Tween 20

5 ml

Apă distilată

895 ml

3.4. Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat proaspăt)

10 x PBS

10,0 ml

Polivinilpirolidonă-44000 (PVP-44)

2,0 g

10% Tween 20

0,5 ml

Lapte praf

0,5 g

Apă distilată

până la 100 ml

3.5. Soluție de substrat de fosfatază alcalină, pH 9,8

Dietanolamină

97 ml

Apă distilată

800 ml

Se amestecă și se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.

Se adaugă apă distilată până la 1 litru.

Se adaugă 0,2 g MgCl(2).

Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de fosfatază (Sigma) la 15 ml de soluție.

4. Tampoane pentru testul DASI ELISA

4.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Apă distilată

1.000 ml

Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul.

4.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4

NaCl

80,0 g

NaH2PO4 ▪ 2H2O

4,0 g

Na2HPO4 ▪ 12H2O

27,0 g

Apă distilată

1.000 ml

4.3. PBS-Tween

10 x PBS

50 ml

10% Tween 20

5 ml

Apă distilată

950 ml

4.4. Tampon de substrat, pH 9,8

Dietanolamină

100 ml

Apă distilată

900 ml

Se amestecă și se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.

Apendicele 5

Stabilirea gradului de contaminare în testele IF și FISH

1. Se calculează numărul mediu de celule fluorescente tipice pe câmp (c).

2. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeul lamei de microscop (C).

C = c x S/s, unde:

S = suprafața (S) a godeului lamei cu multe godeuri, și

s = suprafața (s) câmpului obiectivului

s = PI i2/4G2K2, unde:

i = coeficientul de câmp (depinde de tipul ocularului și variază de la 8 la 24)

K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)

G = grosisment (de 100 de ori, 40 de ori etc.) obiectiv.

3. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe ml de sediment resuspendat (N).

N = C x 1.000/y x F,

unde:

y = volumul de extract concentrat resuspendat

și

per godeu,

F = factorul de diluție al sedimentului

resuspendat

Apendicele 6

Protocoale PCR și reactivi validați

NOTĂ: Testele preliminare trebuie să permită detecția reproductibilă a 10^3-10^4 celule de Ralstonia solanacearum pe ml de extract de probă

De asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o gamă de tulpini bacteriene selecționate (vezi apendicele 3).

1. Protocolul PCR Seal et al. (1993)

1.1. Secvența de oligonucleotide a primerilor

Primer sens OLI-1

5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Primer antisens Y-2

5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Dimensiunea prevăzută a ampliconului de ADN-țintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp

1.2. Amestecul reactiv pentru PCR

Reactiv

Cantitate per reacție

Concentrație finală

Apă ultrapură sterilă

17,65 μl

Tampon PCR x 101 (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

Amestec dNTP (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Primer OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Primer Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Polimerază Taq (5 U/μl)1

0,1 μl

0,5 U

Volumul de ADN extras din probă

2,0 μl

Volum total

25 μl

_______

1) Metoda a fost validată cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) și Gibco BRL.

1.3. Condițiile reacției PCR

Se urmează procedura:

1 ciclu de:

(i)

2 minute la 96°C: denaturarea matriței ADN

35 cicluri de:

(ii)

20 secunde la 94°C: denaturarea matriței ADN

(iii)

20 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri

(iv)

30 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de:

(v)

10 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi)

Se menține la 4°C.

NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) și (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

1.4. Analiza restricției enzimatice a ampliconului

Fragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 37°C cu enzima Ava II.

2. Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000)

2.1. Secvența de oligonucleotide a primerilor

Primer sens Ps-1

5'-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3'

Primer antisens Ps-2

5'-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3'

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ului-țintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.

2.2. Amestecul reactiv pentru PCR

Reactiv

Cantitate per reacție

Concentrație finală

Apă ultrapură sterilă

16,025 μl

Tampon PCR x 101

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fracțiune V) (10%)

0,25 μl

0,1%

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Primer Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Polimerază Taq (5 U/μl)1

0,1 μl

0,5 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

Volum total

25,0 μl

________

1) Metodele au fost validate cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) și Gibco BRL.

NOTĂ: Optimizată inițial pentru termociclorul MJ Research PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.

AmpliTaq de PerkinElmer și tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleași concentrații.

2.3. Condițiile reacției PCR

Se urmează procedura:

1 ciclu de:

(i)

5 minute la 95°C: denaturarea matriței ADN

35 cicluri de:

(ii)

30 secunde la 95°C: denaturarea matriței ADN

(iii)

30 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri

(iv)

45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de:

(v)

5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi)

Se menține la 4°C.

NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) și (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

2.4. Analiza restricției enzimatice a ampliconului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65°C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricție obținute din fragmentul specific de ADN de Ralstonia solanacearum au o lungime de 457 bp și de 96 bp.

3. Protocolul multiplex PCR și cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002)

3.1. Secvența de primer de oligonucleotide

Primer sens Rs-1-F

5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Primer antisens Rs-1-R

5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Primer sens Ns-5-F

5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

Primer antisens Ns-6-R

5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-țintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezența setului de primeri Rs)

Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezența setului de primeri Ns)

3.2. Amestecul reactiv pentru PCR

Reactiv

Cantitate per reacție

Concentrație finală

Apă ultrapură sterilă

12,625 μl

Tampon PCR x 101 (1,5 mM MgCl2)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fracțiune V) (10%)

0,25 μl

0,1%

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer Ns-5-F (10 μM)2

0,15 μl

0,06 μM

Primer Ns-6-R (10 μM)2

0,15 μl

0,06 μM

Polimerază Taq (5 U/μl)1

0,2 μl

1,0 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

Volum total

25,0 μl

_________

1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq de PerkinElmer (AmpliTaq) și Gibco BRL.

2) Concentrațiile primerilor Ns-5-F și Ns-6-R au fost optimizate pentru extracția conurilor de cartof, utilizându-se metoda de omogenizare și pentru metoda de izolare a ADN Pastrik (2000) (vezi secțiunea VI. A.6.1.a). Va fi nevoie de o nouă optimizare a concentrațiilor de reactivi în cazul în care se aplică extracția prin agitare și se folosesc alte metode de izolare de ADN.

3.3. Condițiile reacției PCR

Se urmează procedura:

1 ciclu de:

(i)

5 minute la 95°C: denaturarea matriței ADN

35 cicluri de:

(ii)

30 secunde la 95°C: denaturarea matriței ADN

(iii)

30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri

(iv)

45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de:

(v)

5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi)

Se menține la 4°C.

NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) și (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

3.4. Analiza restricției enzimatice a ampliconului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute.

4. Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia solanacearum (Pastrik et al., 2001)

4.1. Secvența de oligonucleotide a primerilor

Primer sens Rs-1-F

5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Primer antisens Rs-1-R

5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Primer antisens Rs-3-R

5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-țintă de Ralstonia solanacearum:

cu Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

cu Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2. Amestecul reactiv pentru PCR

a) PCR specific biovarului 1/2

Reactiv

Cantitate per reacție

Concentrație finală

Apă ultrapură sterilă

12,925 μl

Tampon PCR x 101

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fracțiune V) (10%)

0,25 μl

0,1%

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Polimerază Taq (5 U/μl)1

0,2 μl

1 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

Volum total

25,0 μl

________

1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) și Gibco BRL.

b) PCR specific biovarului 3/4/5

Reactiv

Cantitate per reacție

Concentrație finală

Apă ultrapură sterilă

14,925 μl

Tampon PCR x 101

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fracțiune V) (10%)

0,25 μl

0,1%

Amestec dNTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Primer Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Polimerază Taq (5 U/μl)1

0,2 μl

1 U

Volumul de ADN extras din probă

5,0 μl

Volum total

25,0 μl

_________

1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) și Gibco BRL.

4.3. Condițiile reacției PCR

Se urmează procedura descrisă în continuare pentru reacțiile specifice biovarului 1/2 și biovarului 3/4/5:

1 ciclu de:

(i)

5 minute la 95°C: denaturarea matriței ADN

35 cicluri de:

(ii)

30 secunde la 95°C: denaturarea matriței ADN

(iii)

30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri

(iv)

45 secunde la 72°C: extinderea ADN

1 ciclu de:

(v)

5 minute la 72°C (extinderea finală)

(vi)

Se menține la 4°C.

NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) și (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

4.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F și Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzima izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F și Rs-3-R nu au puncte de restricție.

5. Prepararea tamponului de încărcare

5.1. Albastru de bromfenol (soluție concentrată de 10%)

Albastru de bromfenol

5 g

Apă distilată (bidistilată)

50 ml

5.2. Tampon de încărcare

Glicerol (86%)

3,5 ml

Albastru de bromfenol (5.1)

300 μl

Apă distilată (bidistilată)

6,2 ml

6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10 x, pH 8,0

Tampon TRIS

48,40 g

Acid acetic glacial

11,42 ml

EDTA (sare disodică)

3,72 g

Apă distilată

1,00 l

Înainte de utilizare se diluează până la 1 x.

De asemenea, acest tampon este disponibil în comerț (de exemplu, Invitrogen sau echivalent).

Apendicele 7

Reactivi validați pentru testul FISH

1. Oligosonde

Sondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia solanacearum: 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3'

Sondă eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

2. Soluția de fixare

Atenție! Soluția de fixare conține paraformaldehidă, care este toxică, se manipulează cu mănuși și nu se inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă chimică.

(i) Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la circa 60°C și se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehida se dizolvă după adăugarea a 5 picături de NaOH 1N și amestecarea pe un agitator magnetic.

(îi) Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a 1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) și 5 picături de HCl 1 N. Se verifică pH-ul cu benzi indicatoare și se ajustează, atunci când este necesar, cu HCl sau NaOH.

Atenție! Nu se folosește pH-metrul în soluții care conțin paraformaldehidă.

(iii) Se filtrează soluția printr-un filtru cu membrană de 0,22 f2μm și se păstrează la 4°C până la utilizare ferită de praf.

3. Hibmix 3 x

NaCl

2,7 M

Tris/HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizată prin filtrare și autoclavată)

15 mM

Se diluează până la 1 x, după cum este prevăzut.

4. Soluție de hibridizare

Hibmix 1 x

Sodiu dodecilsulfat (SDS)

0,01%

Formamidă

30%

Sondă EUB 338

5 ng/μl

Sondă OLI-1 sau OLI-2

5 ng/μl

Se prepară cantitățile de soluție de hibridizare în conformitate cu rețeta din tabelul 1. Pentru fiecare lamă (conținând două probe diferite duplicate) este nevoie de 90 f2μl de soluție de hibridizare.

Important: Formamida este foarte toxică. Prin urmare, se poartă mănuși și se iau măsurile de siguranță necesare!

Tabelul 1. Cantități recomandate pentru prepararea amestecului de hibridizare

Numărul de lame

1

4

6

8

10

Apă ultrapură sterilă

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

Hibmix 3X

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

Sodiu dodecilsulfat (SDS) 1%

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamidă

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Sondă EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Sondă OLI-1 sau OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Volum total (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

NOTĂ: Toate soluțiile care conțin oligosonde sensibile la lumină se păstrează la întuneric, la - 20°C.

Se protejează de lumina directă a soarelui sau de lumina electrică directă în timpul utilizării.

5. Tampon fosfat 0,1 M, pH 7,0

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Apă distilată

1,00 l

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul și se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Apendicele 8

Condiții de cultură pentru vinete și tomate

Se însămânțează semințe de tomate (Lycopersicon esculentum) și de vinete (Solanum melongena) în pământ de seră pasteurizat. Se transplantează plantulele în pământ pentru flori pasteurizat atunci când cotiledoanele sunt dezvoltate în totalitate (10-14 zile).

Vinetele sau tomatele trebuie cultivate în seră, înainte de inoculare, în următoarele condiții de mediu:

Durata zilei: 14 ore sau durata naturală a zilei atunci când este mai mare

Temperatura:

ziua: 21-24°C

noaptea: 14-18°C

Varietatea sensibilă de tomată:

«Moneymaker»

Varietatea sensibilă de vânătă:

«Black Beauty»

Furnizori:

vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

REFERINȚE

1. Amann, R.I., L Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative. Phylogenetic and environmental studies în microbiology. Ț. Bacteriol. 1 72: 762-770.

2. Anon. 1998. Council

Directive 98/5 7/EC

of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. l.abarre and B. (ouan. 1999. Design of division specific primers of (Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 10^5; 373-380.

4. Caruso, P., Gorris, M.T.. Cambra, M.. Palomo, Ț.L. Collar, Ț and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody lor sensitive Detection of Ralstonia solanacearum în Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68. 3634-3638.

5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira. L. 1989. Genetic diversity ol Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive respon. se. Molecular PlantMicrobe Interactions 1:113-121.

6. Elphinstone. J.G., Hcnnessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanaceamm în potato tuber extracts. FPPO Buletin 26: 663-678.

7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. În: A.C. Hayward (ecL) Bacterial Wilt Newsletter 10. 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research. Canberra, Australia.

8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics ol Pseudomonas solanacearum. Journal ol Applied Bacteriology 27: 265-277.

9. Hayward, A.C., El-Nashaar. H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation în nitrate metabolism în biovars of Pseudomonas solanacearm. Journal of Applied Bacteriology 69: 269-280.

10. Ito, S.. Y. Ushijima. T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-lwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum în soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

11. Janse, j.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum în symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Buletin OEPP/EPPO Buletin 18. 343-351.

12. Janse. J.D. 1991. Infra- and inlra-spccilic classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatly-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

13. Kelman, A. 1954. The relationship ol pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14. Klemenl Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods în Phytobacteriology. Akadcmiai Kiado, Budapest, 568 pp.

15. Lelliott. R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd.. Oxford. 216 pp.

16. Lopez. M.M.. Corns, M.T., Hop, P., Cubero. J., Vicedo, B.. Cambra, M., 1 997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. În: H.W. Dehne ft al., (eds). Klewer Academic Publishers, pp. 117-121.

17. Louws, F.J., Fulbright, D.W.. Stephens. C.T. and Dc Bruijn, F.J.. 1994. Specific genomic fingerprints of phytopalhogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, FJ. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85: 528-5 36.

19. Opina, N., F. Tavner. G. Holloway, Ț.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5: 19-33.

20. Pastrik, K.H. and Maiss. E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum în potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21. Pastrik. K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 1 6S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearm, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7. 67-79.

23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide fur identification of plant pathogenic bacteria. Schaad fHrsg. ș.-3. cd.: Și. Paul, Minnesota: 373 pp.

24. Seal, S.E., LA. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum. Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by parțial 16S rRNA sequencing: construction of oligonuclc-oiide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1 594.

25. Smith)., Offord. I..C, Holderness, M. and Snaddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solamcearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 în Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61: 4262-4268.

26. Stead. D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42: 281-295.

27. Taghavi. M., Hayward, A.C.O, Sly, L.I, Fcgan, M. 1996. Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46: 10-15.

28. Van Der Wolf, J.M.. Bonants. P.J.M.. Smith, J.J., Hagcnaar, M., Nijhuis. E., Van Bcckhoven. J.R.C.. Saddler, G.S.. Trigalet. A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 în Western Europe as determined by AFLP. RC-PFGE and rep-PCR. În: Prior. P., Alien, C. and Elphinstonc. J. (eds.) Bacterial will disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

29. Weller, S.A.. Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead. D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanaceanun, which causes brown rot of potato, by fluorescent în situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.