Ordinul nr. 89/2003

Secțiunea 1 Plante de Citrus L, Fortunella Swingle, Poncirus Raf. și hibrizii acestora, altele decât fructele și semințele

1. Materialul, după caz, se supune procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic FAO/IPGRI.

2. Materialul, urmând procedurile de terapie menționate la punctul 1, este indexat.

Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalațiile aprobate, în condițiile de izolare în carantină, menționate în Anexa 1.

Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiții care să permită un ciclu normal de vegetație și se supune inspecției vizuale, la sosire și ulterior, la momente potrivite, pe durata indexării, în vederea identificării semnelor și simptomelor produse de organisme dăunătoare, inclusiv de toate organismele dăunătoare relevante enumerate în

Hotărârea Guvernului nr. 1.030/2001

privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de caran tină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

3. Conform punctului 2, materialul este indexat (testat și identificat) pentru organisme dăunătoare, respectând următoarelor proceduri:

3.1. Testarea este efectuată prin metode adecvate de laborator și când este cazul, plante indicator, inclusiv Citrus sinensis (L.) Osbeck, C. aurantifolia Christm. Swing, C. medica L., C. reticulata Blanco și Sesamum L., pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Citrus greening bacterium

b) Citrus variegated chlorosis

c) Citrus mosaic virus

d) Citrus tristeza virus (toate izolatele)

e) Citrus vein enation woody gall

f) Leprosis

g) Naturally spreading psorosis

h) Phoma tracheiphila (Petri) Kanchaveli & Gikashvili

i) Satsuma dwarf virus

j) Spiroplasma citri Saglio et al

k) Tatter leaf virus

i) Witches broom (MLO)

m) Xanthomonas campestris (toate tulpinile patogene la Citrus)

3.2. Pentru boli precum "Blight and blight like", pentru care nu se poate face indexarea rapidă, materialul trebuie supus, la sosire, testării prin grefarea mugurelui terminal pe un portaltoi crescut în cultură sterilă, conform cu Ghidul tehnic al FAO/IPGRI, iar plantele rezultate se supun procedurilor de terapie prevăzute la pct. 1.

4. Materialul supus inspecțiilor vizuale la care se referă punctul 2 și la care s-au observat semnele și simptomele produse de organismele dăunătoare este supus unei investigații incluzând testarea, când este cazul, pentru identificarea cât mai rapidă a organismelor dăunătoare care au cauzat semnele și simptomele respective.

Secțiunea 2 Plantele de Cydonia Mill, Malus Mill, Prunus L. și Pyrus L. și hibrizii acestora și Fragaria L., destinate plantării, altele decât semințele

1. Materialul se supune, după caz, procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI.

2. Materialul, urmând procedurile de terapie prevăzute la punctul 1, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa.

Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalații, în condițiile de carantină menționate la Anexa 1.

Materialul care trebuie aprobat pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiții favorabile apariției semnelor și simptomelor de organisme dăunătoare, inclusiv toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030 /2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, la sosire și ulterior, la momentele potrivite, în timpul procedurilor de indexare.

3.1. Conform punctului 2, materialul se indexează pentru depistarea organismelor dăunătoare (testare și identificare), după următoarele proceduri:

3.2. Pentru Fragraria L., indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator, inclusiv Fragraria vesca, F. virginiana și Chenopodium spp. pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Arabis mosaic virus

b) Raspberry ringspot virus

c) Strawberry crinkle virus

d) Strawberry latent "C" virus

e) Strawberry latent ringspot virus

f) Strawberry mild yellow edge virus

g) Strawberry vein banding virus

h) Strawberry witches' broom MLO

i) Tomato black ring virus

j) Tomato ringspot virus

k) Colletotrichum acutatum Simmonds

l) Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox & Duncan

m) Xanthomonas fragariae Kennedy & King

3.2.1. În cazul Malus Mill: când materialul provine dintr-o țară care nu este cunoscută a fi liberă de unul din următoarele organisme dăunătoare:

a) Apple proliferation mycoplasm; sau

b) Cherry rasp leaf virus (American), pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante și,

3.2.2. Indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea a cel puțin următoarelor organisme dăunătoare:

a) Tobacco ringspot virus

b) Tomato ringspot virus

c) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al.

3.3. Pentru Prunus L., după caz, pentru fiecare specie de Prunus:

(1) Când materialul este originar dintr-o țară care nu este cunoscută a fi liberă de oricare din următoarele organisme dăunătoare:

a) Apricot chlorotic leafroll mycoplasm;

b) Cherry rasp leaf virus (American); sau

c) Pseudomonas syringae pv. persicae (Prunier et al.) Young et al., pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante și

(2) Indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Little cherry pathogen (izolate non-Europene)

b) Peach mosaic virus (American)

c) Peach phony rickettsia

d) Peach rosette mosaic virus

e) Peach rosette mycoplasm

f) Peach X disease mycoplasm

g) Peach yellows mycoplasm

h) Plum line pattern virus (American)

i) Plum pox virus

j) Tomato ringspot virus

k) Xanthomonas camperesis pv. pruni (Smith) Dye.

3.4. În cazul Cydonia Mill și Pyrus L., indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator, și, când este cazul, plante indicator, pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al.

b) Pear decline mycoplasm

4. Materialul supus inspecțiilor vizuale menționate la punctul 2 și la care s-au observat semne și simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigații, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare ce au cauzat semnele și simptomele respective.

Secțiunea 3 Plantele de Vitis L., altele decât fructele

1. Materialul se supune, după caz, procedurii adecvate de terapie, prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI.

2. (1) Materialul, urmând procedurile de terapie menționate la punctul 1, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa.

(2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalațiile aprobate, în condițiile de carantină specificate în Anexa 1.

(3) Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantină se păstrează în condiții care să permită un ciclu vegetativ normal și va fi supus inspecției vizuale efectuate la sosire și ulterior, la momente potrivite, în timpul perioadei procedurilor de indexare, pentru detectarea semnelor și simptomelor produse de organismele dăunătoare, inclusiv cele cauzate de Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) și ale tuturor celorlalte organisme dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030 /2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

Conform punctului 2, materialul se indexează pentru testarea și depistarea organismelor dăunătoare (testat și identificat) în conformitate cu următoarele proceduri:

3. Pentru materialul care provine dintr-o țară care nu este cunoscută ca fiind liberă de următoarele organisme dăunătoare:

a) Boala Ajinashika. Pentru testare se folosește o metodă adecvată de laborator iar, în cazul unui rezultat negativ, materialul vegetal va fi altoit pe soiul Koshu și ținut sub observație cel puțin două cicluri de vegetație.

b) Grapevine stunt virus. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiul Campbell Early, iar observațiile se fac timp de un an.

c) Summer mottle. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiurile Sideritis, Cabernet-Franc și Mission.

Indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

(a) Blueberry leaf mottle virus

(b) Grapevine flavescence doree MLO și altele (Grapevine yellows)

(c) Peach rosette mosaic virus

(d) Tobacco ringspot virus

(e) Tomato ringspot virus (sușa "yellow vein" și alte sușe)

(f) Xylella fastidiosa (Well & Raju)

(g) Xylophilus ampelinus (Panagopoulos) Willems et al.

4. Materialul supus inspecției vizuale prevăzută la punctul 2 și pe care au fost observate semne și simptome de organisme dăunătoare se supune unei investigații care să includă testarea, unde este necesar, pentru a determină cât mai rapid posibil identitatea organismelor dăunătoare care cauzează semnele și simptomele.

Secțiunea 4 Plante ale speciei Solanum L. care formează stoloni sau tuberculi sau hibrizii lor, destinate plantării

1. Materialul, după caz, se supune procedurilor de tratament prevăzute în Ghidul Tehnic FAO/IPGRI.

2. (1) Se indexează fiecare unitate a materialului, urmând procedurile de tratament prevăzute la punctul 1.

(2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalațiile aprobate, în condițiile de carantină prevăzute în Anexa 1.

(3) Materialul destinat scoaterii din carantină se păstrează în condiții care să permită un ciclu normal de creștere vegetativă și se inspectează vizual pentru semne și simptome produse de organismele dăunătoare, inclusiv de toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numărul 1.030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România și Potato yellow vein disease, la sosire și ulterior, la intervale regulate, până la sfârșitul ciclului vegetativ, pe toată perioada procedurilor de indexare.

3. Procedurile de indexare menționate la punctul 2 urmează prevederile tehnice de la punctul 5, pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

A. - Bacterii

a) Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al;

b) Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, cunoscută și sub numele de Ralstonia solanacearum (Smith) Smith.

B. - Virusuri și organisme analoage

a) Andean potato latent virus,

b) Potato black ringspot virus,

c) Potato spindle tuber viroid,

d) Potato yellowing alfamovirus,

e) Potato virus T,

f) Andean potato mottle virus,

g) Common potato viruses A, M, S, V, X și Y (incluzând Y(5), Yn și Yc) și Potato leaf roll virus.

În cazul seminței de cartof, procedurile de indexare se aplică pentru a detecta cel puțin virusurile și organismele asemănătoare virusurilor listate mai sus de la a) la e)

4. Materialul supus inspecțiilor vizuale menționate la punctul 2 și la care se observă semne și simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigații, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare care au cauzat semnele și simptomele respective.

5. Prevederile tehnice menționate la punctul 3 sunt următoarele:

A. - Bacterii

a) Pentru tuberculi, se testează țesutul din jurul punctului de inserție al fiecărui tubercul, mărimea probei standard fiind de 200 tuberculi, procedura putând fi aplicată convenabil și pentru probele cu mai puțin de 200 tuberculi.

b) Pentru plantele ținere și butași, inclusiv micro-plante, se testează partea bazală a tulpinii și când este cazul, rădăcinile, pentru fiecare unitate a materialului.

c) Testarea tuberculilor nou formați, sau a bazei tulpinii, pentru speciile care nu formează tuberculi, este recomandată pentru un ciclu normal de creștere vegetativă care urmează testării menționate la punctul a și b.

d) Pentru materialul menționat la punctul a, în vederea testării metoda de testare pentru Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) David et al. se folosește metoda descrisă în secțiunea 5 a prezentei Anexe. Pentru materialul menționat la punctul b, poate fi aplicată aceeași metodă de testare.

e) Pentru materialul menționat la punctul a, în vederea testării pentru Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, Ralstonia solanacearum (Smith) Smith, se aplică metodele aprobate prin Ordin al Ministrului Agriculturii, Alimentației și Pădurilor.

B. - Virusuri și organisme analoage virusurilor, altele decât Potato spindle tuber viroid.

a) Testarea minimă pentru tuberculi, plante ținere și butași, incluzând micro-plante, include un test serologic făcut la sau aproape de înflorire pentru fiecare din organismele dăunătoare listate, altele decât Potato spindle tuber viroid, urmat de un test biologic al materialului găsit negativ la testul serologic,

b) Pentru Potato leaf roll virus, se fac două teste serologice.

c) Testarea minimă pentru sămânța de cartof constă într-un test serologic sau biologic, dacă nu este disponibil unul serologic. Pentru probele găsite negative se recomandă retestarea unei părți din probe; pentru rezultatele incerte, se face testarea materialului prin altă metodă.

d) Testările serologice și biologice menționate la punctul 5 B(a)(b)(c) vor fi făcute pe plante crescute în seră, pe probe luate din cel puțin două poziții de pe fiecare tulpină, incluzând o frunză tânără întreagă din vârful fiecărei tulpini și o frunză mai veche de la mijlocul tulpinii.

Trebuie ridicate probe din fiecare tulpină datorită posibilei existențe a unei infecții nesistemice.

În cazul testelor serologice, proba de analizat trebuie să fie formată din frunze prelevate de pe aceeași plantă.

Nu se recomandă amestecarea frunzelor prelevate de la mai multe plante decât dacă proporția de amestec a fost validată printr-o metodă specială.

În cazul testărilor biologice, proba este formată din frunze prelevate de la maxim cinci plante cu inocularea a cel puțin două plante din fiecare specie indicator.

e) Plantele indicator adecvate pentru folosire în testarea biologică menționată la punctul 5 B(a), (c) sunt cele listate de către Organizația Europeană și Mediteraneană pentru Protecția Plantelor (OEPP), sau alte plante indicator aprobate oficial, despre care s-a dovedit că detectează virusurile respective.

f) Se scoate din carantină numai materialul care a fost direct testat.

După efectuarea testării ochiurilor, se scoate din carantină numai materialul (plantulele) rezultat din tuberculii analizați.

Nu este permisă scoaterea din carantină a tuberculului ca atare din cauza posibilelor probleme cu infecțiile nonsistemice.

C. - Potato spinale tuber viroid

a. (1) Pentru întregul material, se testează plante cultivate în seră, de îndată ce s-au acomodat bine, dar înainte de înflorire și producerea polenului.

(2) Testarea lăstarilor tuberculilor, a plantulelor crescute în vitro sau a răsadurilor ținere este privită numai ca o testare preliminară.

b. Probele se alcătuiesc dintr-o frunză complet dezvoltată din vârful fiecărei tulpini a plantei.

c. Întregul material pentru testare se cultivă la temperaturi care să nu fie mai mici de 18°C (preferabil la temperaturi mai mari de 20°C) și la o fotoperioadă de cel puțin 16 ore.

d. Testarea probelor de ADN și ARN se face prin marcare radioactivă sau neradioactivă, return-PAGE (prin colorare cu Ag) sau prin RT-PCR.

e. Proporția maximă de amestecare pentru alcătuirea unei probe și return-PAGE este de cinci plante, iar utilizarea acesteia sau a proporțiilor mai mari trebuie validată.

Secțiunea 5

Metoda pentru detectarea și diagnosticarea bacteriei care provoacă putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. în loturile de tuberculi de cartofi
1. Prelevarea conurilor.
1.1. Se spală 200 de tuberculi în apa de la robinet și de îndepărtează epiderma din jurul punctului de inserție al fiecărui tubercul de cartof, folosind un bisturiu sau un cuțit de curățat cartofi, dezinfectat periodic; dezinfecția de poate face prin înmuierea cuțitului în soluție de ethanol 70% înainte de flambare.
1.2. a) Se scot cu grijă conuri de țesut din punctul de inserție al cartofului cu un bisturiu sau un cuțit de cartofi, evitându-se prelevarea de țesut nevascular în exces.
b) După scoatere, conurile trebuie: prelucrate în maxim 24 de ore (v. paragraful 3) sau păstrate timp de maxim două săptămâni, la o temperatură de -20° C.
2. Examinarea vizuală a simptomelor veștejirii bacteriene.
După scoaterea conurilor, se secționează fiecare tubercul și se caută prezența simptomelor de putregai inelar.
Se storc tuberculi și se urmărește dacă din țesutul vascular exudează țesuturi macerate.
Simptomele timpurii se prezintă sub forma unui aspect ușor sticlos sau translucid a țesutului, fără înmuiere în jurul țesutului vascular; aceste simptome în special în punctul de inserție al tuberculului.
Inelul vascular poate prezenta, la punctul de inserție, o culoare ușor mai închisă decât cea normală.
Primele simptome ușor identificabile apar sub forma unei colorații gălbui a inelului vascular. Când tuberculul este presat ușor, din vase se elimină un exudat cu un aspect brânzos. Acest exudat conține milioane de bacterii și, în această fază, se poate produce o colorare brună a țesutului vascular.
La început, aceste simptome pot apărea doar pe o parte a inelului, nu neapărat în apropierea punctului de inserție, și apoi se extind treptat pe tot inelul.
Pe măsură ce infecția avansează, țesuturile vasculare sunt distruse și cortexul extern se poate separa de cel intern.
În stadiile avansate ale infecției, apar crăpături la suprafața tuberculului, având adesea o culoare brun-roșiatică pe margini.
Simptomele pot fi mascate de invazii fungice sau bacteriene secundare și este foarte dificil, dacă nu imposibil, să se distingă simptomele avansate ale putregaiului inelar de celelalte putregaiuri ale tuberculului.
3. Pregătirea probelor pentru colorația Gram, colorarea prin imunofluorescență (IF) și testul pe vinete
3.1. Se omogenizează conurile până la macerare completă într-un diluant cunoscut ca fiind netoxic pentru Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu tampon fosfat salin 0.05 M (TFS) de 0.05 M și pH 7.0), la o temperatură mai mică de 30 de grade C. Se recomandă adăugarea unui defloculant netoxic și a unui agent antispumant netoxic (apendice 1 și 2). Trebuie evitată o macerare excesivă.
3.2 Se extrag bacteriile din amestecul omogen prin una din metodele următoare*1):
------------
*1) O metodă de extracție alternativă este dată de Dinesen, 1984.
A. a) Se centrifughează la nu mai mult de 180 g timp de 10 minute;
b) Se centrifughează supernatantul la nu mai puțin de 4000 g timp de 10 minute. Se lasă la decantat, iar apoi supernatantul se elimină.
B. a) Se lasă maceratul în repaus timp de 30 de minute pentru ca resturile de țesut să se poată depune. Se decantează supernatantul fără a tulbura sedimentul.
b) Se filtrează supranatantul printr-un filtru de hârtie (Whatman nr. 1) ținut într-un filtru de sticlă poroasă (nr. 2 = 40 - 100 мm) folosind o pompă de vacuum adaptată la sursa de apă. Se colectează filtratul într-un tub de centrifugă. Se spală filtrul cu tampon fosfat salin steril până la obținerea unui volum maxim al filtratului de 35 ml.
c) Se centrifughează filtratul la nu mai puțin 4000 g timp de 20 de minute.
3.3. Se suspendă depozitul în tampon fosfat salin steril 0.01 M, ph 7.2 (apendice 2) până la obținerea unui volum total de aproximativ 1 ml. Se divizează în două părți egale și se păstrează o parte în scopuri de referință prin congelare la -20°C*1) sau prin liofilizare. Cealaltă jumătate se divizează în două părți egale, utilizând una pentru testul IF și colorația Gram și cealaltă pentru testul vinetei.
-----------
*1) Există dovada (Jansr și Van Varrenberg, 1987) că prin congelare se poate reduce viabilitatea lui C.m. spp. Sepedonicus. Se recomandă suspensia depozitului în soluție de glicerol 10%.
3.4. Pentru a evita orice contaminare, este obligatoriu ca martorii pozitivi de C.m. ssp. sepedonicus și probele să fie tratate separat, atât pentru testul de IF cât și pentru testul vinetei.
4. Colorația Gram
4.1. Se prepară colorații Gram pentru toate diluțiile depozitului (punctul 5.2.1.) și pentru tuberculii tăiați (punctul 2) care prezintă simptome de putregai inelar sau alte simptome suspecte. Probele se prelevează de pe marginea țesuturilor bolnave.
4.2. Se prepară colorații Gram pentru culturile cunoscute de C.m. spp. sepedonicus și, dacă este posibil, și pentru țesuturile infectate natural (punctul 5.1).
4.3. Se identifică probele care conțin celule corineforme tipice, Gram pozitive. În general, celulele de C.m. spp. sepedonicus au o lungime de 0,8 până la 1,2 мm și o lățime de 0,4 până la 0,60 um.
În apendicele 3 se indică un procedeu de colorare adecvat.
Preparatele din infecții naturale sau culturi recent izolate prezintă adesea o predominanță de bastonașe cocoide, care sunt de obicei mai mici decât celulele din culturile mai vechi însămânțate pe mediu de agar. În majoritatea mediilor de cultură, celulele de C.m. spp. sepedonicus se prezintă ca niște bastonașe corineforme pleomorfe și pot da o reacție Gram variabilă. Celulele sunt unice, în perechi cu "coturi" caracteristice, tipice pentru divizarea corinebacteriilor și, ocazional, în grupuri neregulate asemenea unor palisade și litere chinezești.
5. Protocol pentru testarea IF
5.1. Se utilizează un antiser pentru o tulpină cunoscută de C.m. spp. sepedonicus - ATCC 33113 (NCPPB 2137) sau NCPPB 2140. Aceasta trebuie să aibă un titru IF mai mare de 1:600. Se include un control TFS pe lama de testare pentru a se determina dacă imunoglobulina anti-iepure conjugată cu izotiocianat de fluoresceină (ITCF) se combină nespecific cu celulele bacteriene. C.m. spp. sepedonicus (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) ar trebui utilizat ca și control de antigen omolog pe o lamă separată. Țesutul infectat natural (conservat prin liofilizare sau congelare la -20°C) se utilizează, dacă este posibil, ca un control similar pe aceeași lamelă (figura 2).
5.2. Procedeul
5.2.1. Din depozitul-final, se prepară trei serii de diluții (10θ, 10κ, 10â) în apă distilată (figura 1).
5.2.2. Din fiecare diluție a depozitului său din fiecare suspensie de C.m. spp. sepedonicus (aproximativ 10^6 celule/ml), se pipetează un volum standard măsurat, suficient pentru a acoperi godeul (aproximativ 25 мl), în godeurile unei lame cu spoturi multiple după cum se prezintă în figura 1.
5.2.3. Se lasă la uscat la o temperatură de aproximativ 37°C și se fixează cu soluție de etanol 95% sau prin flambare.
5.2.4. Se acoperă godeurile respective cu antiser pentru C.m. spp. sepedonicus la diluțiile recomandate, TFS de 0.01, pH 7.2, conform figurii 1. (Se utilizează TFS pentru controlul ITCF). Diluția de lucru a antiserului trebuie să fie egală cu aproximativ jumătate din titrul IF. Dacă trebuie folosite alte diluții antiser, se pregătesc lame separate pentru fiecare diluție ce urmează a fi utilizată.
5.2.5. Se incubează într-o cameră umedă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute.
5.2.6. Se clătește cu grijă cu TFS de 0,01 M și pH 7,2. Se spală timp de 5 minute în trei reprize cu TFS 0,01 M și pH 7,2, schimbându-se de fiecare dată soluția de spălare.
5.2.7. Se elimină cu grijă excesul de umezeală.
5.2.8. Se acoperă fiecare godeu cu conjugat ITCF în aceeași diluție utilizată pentru determinarea titrului și se incubează într-o cameră umedă întunecoasă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute.
5.2.9. Se clătește și se spală ca mai înainte.
5.2.10. În fiecare godeu, se pun 5 până la 10 мl de glicerină tamponată cu fosfat 0.1 M, cu pH 7,6 (sau o valoare similară cu un pH de minimum 7,6) și se acoperă cu o lamelă (apendice 2).
5.2.11. Se examinează cu un microscop prevăzut cu o sursă de lumină epifluorescentă și filtre adecvate pentru ITCF. Se recomandă folosirea unui obiectiv cu o putere de mărire de 400x până la 1000x. Se scanează fiecare godeu replicat de-a lungul a două diametre perpendiculare și de-a lungul perimetrului acestuia.
Se observă celulele fluorescente din controalele pozitive și se determină titrul acestora. Se observă celulele fluorescente din godeul de control ITCF/TFS și, dacă acestea sunt absente, atunci se continuă cu godeurile de test. Se determină, în minimum 10 câmpuri microscopice, numărul mediu de celule fluorescente tipice morfologic per câmp și se calculează populația de celule pe mililitru de depozit nediluat (apendice 4).
În timpul testului de imunofluorescență, pot apărea mai multe probleme.
- Populații de bacterii saprofite pot indica celule fluorescente atipice morfologic și pot provoca reacții încrucișate. Alte bacterii pot părea asemănătoare cu C.m. ssp. sepedonicus ca talie și morfologie. Se iau în considerare doar celulele fluorescente cu talie și morfologie tipice.
Din cauza posibilității producerii unor reacții încrucișate, probele cu un test de imunofluorescență pozitiv trebuie să fie retestate utilizând un antiser diferit.
- Limita tehnică de detecție a acestei metode se situează între 10â și 10" celule pe ml de depozit nediluat. Probele cu un număr de celule tipice fluorescente la limita detecției sunt de obicei libere de C.m. ssp. sepedonicus, dar pot fi supuse testului vinetei.
Testul IF este negativ pentru toate probele în care nu s-a găsit nici o celulă fluorescentă cu morfologie tipică. Se consideră că aceste probe sunt "necontaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus.
Testul vinetei nu este necesar.
Testul IF este pozitiv pentru toate probele în care s-au identificat celule fluorescente cu morfologie tipică.
Probele la care s-a identificat un test de imunofluorescență pozitiv cu ambele antiseruri sunt considerate ca "potențial contaminate" cu C.m. ssp. sepedonicus.
Testul vinetei este necesar pentru toate probele considerate a fi potențial contaminate.
6. Testul vinetei
Pentru detalii de cultură, vezi apendicele 5.
6.1. Depozitul obținut la punctul 3.3 se inoculează la cel puțin 25 de vinete aflate în stadiu de trei frunze (apendice 5) printr-una din metodele indicate mai jos (punctele 6.2, 6.3 sau 6.4).
6.2. Inoculare prin tăiere I
6.2.1. Se așează fiecare ghiveci în poziție orizontală într-o excavație făcută pe o placă de polistiren expandat cu dimensiunile de 5 cm x 10 cm x 15 cm (H x l x L) (figura 3); excavația de mai sus este adecvată pentru un ghiveci de 10 cm. Între tulpina vinetei și placa de polistiren expandat se introduce o folie de aluminiu sterilă pentru fiecare mostră testată. Planta este fixată în jurul plăcii cu o bandă de cauciuc.
6.2.2. Cu ajutorul unui bisturiu, se execută între cotiledoane și prima frunză o tăietură longitudinală sau ușor diagonală de 0,5 până la 1 cm lungime și cu o adâncime de aproximativ trei pătrimi din diametrul tulpinii.
6.2.3. Se ține deschisă tăietura cu vârful lamei bisturiului și cu ajutorul unei pensule fine, înmuiată în inocul, se tamponează pereții tăieturii.
Toate vinetele se inoculează în mod asemănător.
6.2.4. Se închide tăietura cu vaselină sterilă, folosind o seringă de 2 ml.
6.3. Inoculare prin tăiere II
6.3.1. Se ține planta între două degete și se pipetează o picătură (circa 5 până la 10 мl) din inocul pe tulpină, între cotiledoane și prima frunză.
6.3.2. Utilizând un bisturiu steril, se execută o tăietură în diagonală (într-un unghi de aproximativ 5°), cu o lungime de 1,0 cm și o adâncime de aproximativ 2/3 din grosimea tulpinii, tăietura începând de la picătura de inocul.
6.3.3. Se închide tăietura cu vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi.
6.4. Inoculare prin seringă
6.4.1. Vinetele nu se udă cu o zi înaintea inoculării pentru a reduce turgescența.
6.4.2. Se inoculează tulpinile de vânătă exact deasupra cotiledoanelor folosind o seringă cu ac hipodermic (de minimum 23G). Se distribuie inoculul între toate plantele.
6.5. Se inoculează 25 de vinete cu o cultură cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus și, dacă este posibil, cu un țesut de tubercul infectat (punctul 5.1.) prin aceeași metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.).
6.6. Se inoculează 25 de vinete cu TFS steril de 0,05 M prin aceeași metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.).
6.7. Vinetele se incubează în condiții corespunzătoare (apendice 5) timp de 40 de zile. Se examinează regulat simptomele după opt zile. Se numără vinetele care prezintă simptome. C.m. ssp. sepedonicus cauzează ofilirea frunzelor vinetelor, care poate începe ca o înmuiere marginală sau internervuriană.
Țesutul ofilit poate să aibă inițial o culoare verde închis sau pestriță dar care devine mai pală înainte de necrozare. Ofilirile internervuriene au adesea un aspect unsuros apos. Țesutul necrozat are a deseori o margine galbenă strălucitoare. Vinetele nu mor neapărat; cu cât este mai îndelungată perioada care precede apariția simptomelor cu atât cresc șansele de supraviețuire. Vinetele pot învinge infecția.
Vinetele ținere susceptibile sunt mult mai sensibile la populațiile reduse de C.m. ssp. sepedonicus decât plantele mai bătrâne, de unde necesitatea de a utiliza vinete aflate în stadiu de trei frunze sau exact înaintea acestuia.
Ofilirile pot fi provocate de asemenea de populații de alte bacterii sau ciuperci prezente în depozitul țesutului de tubercul. Acestea includ Erwinia carotovora, ssp. carotovora și E. Carotovora ssp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata precum și de populații mari de bacterii saprofite. Aceste ofiliri pot fi deosebite de cele cauzate de C.m. ssp. sepedonicus deoarece toate frunzele sau întreaga vânătă se ofilesc rapid.
6.8. Se prepară o colorație Gram (punctul 4) pentru toate loturile de vinete care prezintă simptome, utilizând secțiuni de țesut de frunză ofilită și de tulpină de vânătă și se izolează într-un mediu nutritiv adecvat (punctul 7). Se dezinfectează frunzele și tulpinile vinetelor prin ștergere cu o soluție de etanol 70%.
6.9. În anumite cazuri, în special dacă condițiile de creștere nu sunt optime, este posibil ca C.m. ssp. sepedonicus să existe ca o infecție latentă în vinete chiar după incubația de 40 de zile. Aceste infecții pot avea ca rezultat piticirea și pierderea vigorii vinetelor inoculate. Dacă testul IF este considerat pozitiv, se poate considera că este necesară o testare suplimentară. Este esențial să se compare ratele de creștere ale tuturor plantelor supuse testului vinetei cu controalele inoculate cu TFS steril de 0,05 M și să se monitorizeze condițiile de mediu din seră.
Recomandările pentru testele ulterioare sunt următoarele:
6.9.1. Se taie tulpinile deasupra locului inoculării și se îndepărtează frunzele.
6.9.2. Se macerează tulpinile în TFS de 0,05 M și pH 7,0 ca la punctele 3.1 până la 3.2.
6.9.3. Se utilizează o jumătate de suspensie pentru a efectua o colorație Gram (punctul 4) și un test IF (punctul 5).
6.9.4. Se utilizează cealaltă jumătate pentru un nou test al vinetei (punctul 6), dacă colorația Gram și/sau testele IF sunt pozitive. Se folosește o cultură cunoscută C.m. ssp. sepedonicus și controale sterile de TFS 0,05 M. Dacă nu se observă simptome în testul ulterior, proba este considerată negativă.
7. Izolarea lui C.m. ssp. sepedonicus
Diagnosticul poate fi confirmat doar dacă C.m. ssp. sepedonicus este izolat și identificat ca atare (punctul 8). Deși C.m. ssp. Sepedonicus este un organism dificil, el poate fi izolat din țesutul care prezintă simptome. Totuși el poate fi mascat prin creșterea rapidă de bacterii saprofite și de aceea, izolarea directă din depozitul de țesut de tubercul (punctul 3.3.) nu este recomandată. Vinetele asigură un excelent mediu selectiv de îmbogățire pentru dezvoltarea lui C.m. ssp. sepedonicus și, de asemenea, un excelent test gazdă de confirmare.
Se fac izolări din toți tuberculii de cartof și vinete care prezintă simptome (punctele 4, 6). Dacă este necesar, macerarea tulpinilor vinetelor se face ca la punctele 3. și 6.9.
7.1. Suspensiile se însămânțează în striuri pe unul din următoarele medii (formulele sunt indicate în apendicele 6):
nutritiv dextroză-agar (numai pentru subculturi),
drojdie-peptonă-glucoză-agar,
drojdie-dextroză-agar,
drojdie de extract de săruri minerale agar.
Se incubează la 21°C timp de 20 de zile.
C.m. ssp. sepedonicus crește încet, producând de obicei colonii cu un vârf ascuțit, cremos, de forma unei cupole, în termen de 10 zile.
Pentru stabilirea purității, suspensia se reînsămânțează în striuri
Ratele de creștere sunt îmbunătățite prin subculturi. Coloniile tipice sunt de un alb cremos sau ivoriu, rotunde, netede, înălțate, cu formă de cupolă convexă, mucoid fluide, cu margini întregi și cu un diametru de 1 până la 3 mm.
8. Identificarea
Din plantele sănătoase sau bolnave de cartofi și vinete se pot izola numeroase bacterii corineforme Gram pozitive, cu caractere coloniale similare celor produse de C.m. ssp. sepedonicus. În acest context, C.m. ssp. sepedonicus poate fi identificat prin următoarele teste:
Testul IF (punctul 5.1),
testul vinetei,
testele de nutriție și fiziologice (apendice 7),
- testul oxidării/fermentării (O/F),
- testul oxidazei,
- creșterea la 37°C,
- producția de urează,
- hidroliza esculinei,
- hidroliza amidonului,
- toleranța la o soluție de clorură de sodiu 7%,
- testul indolului,
- testul catalazei,
- producția de H(2)S,
- utilizarea citratului,
- hidroliza gelatinei,
- acid din: glicerol, lactoză, ramnoză și salicină,
- colorația Gram.
Toate testele trebuie să includă un control cunoscut de C.m. ssp. sepedonicus. Testele nutriționale și fiziologice se fac utilizând inoculări din subculturile agar. Comparațiile morfologice se fac din culturi de dextroză agar.
Pentru testul IF, populațiile de celule trebuie să fie ajustate la 10^6 celule/ml. Titrul IF trebuie să fie similar celui al culturii cunoscute de C.m. ssp. sepedonicus.
Pentru testul vinetei, populațiile de celule trebuie să fie ajustate la 10^7 celule/ml. Testele vinetei se fac utilizând zece plante pentru fiecare din organismele testate, utilizând din nou cultura cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus și controale de apă sterilă; în cazul culturilor pure ofilirea se obține în 20 de zile, dar plantele care nu prezintă simptome după această perioadă trebuie să fie incubate pe o durată totală de 30 de zile, la temperaturi care să determine dezvoltarea vinetelor dar fără să depășească 30°C (apendicele 5).
Dacă după 30 de zile simptomele nu sunt prezente, nu se poate confirma prezența lui C.m. ssp. sepedonicus în cultura respectivă.
Testul
C.m. ssp. Sepedonicus
O/F
Inert sau slab oxidativ
Oxidază
-
Catalază
+
Reducția nitraților
-
Activitatea ureazei
-
Producția de H'S
-
Producția de indol
-
Utilizarea citraților
-
Hidroliza amidonului
- sau slab
Creșterea la 37°
-
Creșterea în soluție de NaCl 7%
-
Hidroliza gelatinei
-
Hidroliza esculinei
+
Acid din:
- glicerol
-
- lactoză
- sau slab
- ramnoză
-
- salicină
_
Apendicele 1
FORMULA FLUIDULUI DE MACERARE RECOMANDAT DE LELLIOTT ȘI SELLAR, 1976
Compus DC silicon MS A (Hopkins Williams
10 ml
Ltd, Cat. Nr. 9964 - 25, Chadwell Heatch,
Essex, Anglia)
Fulgi de lubrol W (ICI Ltd)
0,5 g
Pirofosfat de tetrasodiu
1 g
Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0
1 litru
(apendicele 2)
Apendicele 2
SOLUȚII TAMPON
Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0
Această soluție tampon poate fi folosită pentru macerarea țesuturilor
de tuberculi (2.1.)
Na(2)HPO(4)
4,26 g
KH(2)PO(4)
2,72 g
NaCl
8,0 g
Apă distilată până la
1 litru
Tampon fosfat salin de 0,01 M cu pH 7,2
Această soluție tampon este utilizată pentru diluarea antiserurilor și spălarea lamelelor IF
Na(2)HPO(4) ● 12 H(2)O
2,7 g
NaH(2)PO(4) ● 2 H(2)O
0,4 g
NaCl
8,0 g
Apă distilată până la
1 litru
Glicerină fosfatică tamponată de 0,1 M cu pH 7,6
Această soluție tampon este utilizată pentru mărirea fluorescenței în cadrul testului IF
Na(2)HPO(4) ● 12 H(2)O
3,2 g
NaH(2)PO(4) ● 2 H(2)O
0,15 g
Glicerol
50 ml
Apă distilată
100 ml
Apendicele 3
PROCEDEUL COLORĂRII GRAM (MODIFICAREA LUI HUCKER) (DOETSCH, 1981)
Soluție de cristale violete
Se dizolvă 2 g de violet cristalin în 20 ml etanol 95%.
Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 ml apă distilată.
Se amestecă soluțiile.
Iodul Lugol
Iod 1 g
Iodură de potasiu 2 g
Apă distilată 300 ml
Cristalele solide sunt pisate într-un mojar. Se adaugă apă și se agită până la dizolvare într-un recipient închis.
Soluția de colorare cu safranină
Se alcătuiește soluția:
Safranină O 2,5 g
Etanol 95% 100 ml
Se amestecă și se stochează.
Se diluează: 1:10 pentru a obține o soluție de lucru.
Procedeul de colorare
1. Se pregătesc frotiurile și dispozitivele de uscare și încălzire cu aer.
2. Se imersează lamela într-o soluție de violet cristalin timp de un minut.
3. Se spală cu apă de la robinet.
4. Se imersează în iod Lugol timp de un minut.
5. Se spală cu apă de la robinet și se usucă cu un absorbant.
6. Se decolorează cu etanol 95%, adăugat prin picurare, până când nu se mai decolorează sau se imersează în etanol timp de 30 de secunde, agitând ușor.
7. Se spală cu apă de la robinet și se usucă cu un absorbant.
8. Se imersează în soluție de safranină timp de 10 secunde.
9. Se spală cu apă de la robinet și se usucă cu un absorbant.
Colorația bacteriilor Gram pozitive este violet-albastră; bacteriile Gram negative au o colorație roz-roșie.
Apendicele 4
DETERMINAREA POPULAȚIEI DE CELULE POZITIVE LA TESTUL IF
piD²
Aria (S) godeului lamelei multispot = ──── (1)
4
Unde D = diametrul ferestrei.
pid²
Aria (s) câmpului obiectivului = ──── (2)
4
unde d = diametrul crmpului.
Se calculează d prin măsurare directă sau prin formulele următoare:
pi●i²
s = ────── (3)
G²K²x4
unde i = coeficientul crmpului (depinde de tipul ocularului și variază
de la 8 la 24)
K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)
G = puterea de mărire (100 x, 40 x, etc.) a obiectivului
┌─────
din (2), se obține d =
│4s/pi
\│
┌─────────
│
pi●i²
─
│4x ──────
\
│
G²K²x4
i
din (3), se obține d =
\ │───────── = ── (4)
\│
pi
GK
Se numără celulele fluorescente tipice pe câmp (c).
Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe godeu (C).
S
C = c ● ─
s
Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe ml de depozit (N).
1000
N = Cx ──── x F
y
unde y = volumul depozitului pe godeu,
unde F = factorul de diluție a depozitului.
Apendicele 5
CULTURA VINETELOR
Se însămânțează semințe de vânătă (Solanum melongena cv. Black Beauty) într-un compost pasteurizat pentru semințe. Se plantează plantulele cu cotiledoane complet dezvoltate (10-14 zile) într-un compost pasteurizat pentru ghivece.
Se utilizează vinete în stadiu de trei frunze, atunci când cel puțin două dar nu mai mult de trei frunze sunt desfăcute complet.
Vinetele trebuie să fie cultivate în seră, în următoarele condiții:
durata zilei: 14 ore de lumină naturală sau mai mult;
temperatura: ziua: 21 până la 24°C,
noaptea: 15°C.
N.B.: C.m. ssp. sepedonicus nu crește la temperaturi de peste 30°C.
Dacă temperaturile nocturne nu scad la 15°C se poate produce deteriorarea cromoforului (necroza argintie).
Deteriorarea rădăcinii cauzate de larvele sciaride poate fi evitată prin aplicarea unui insecticid adecvat.
Vânăta Black Beauty poate fi obținută de la firmele următoare:
1. AB Hammenhogs Fro,
50-Hammenhog,
Sweden;
2. HURST Seeds Ltd,
Avenue Road,
Witham,
Essex CM8 2DX,
England;
3. ASGRO Italia Sp A,
Corso Lodi, 23,
Milan;
4. KUPPER
Mitteldeutsche Samen GmbH,
Hessenring 22,
D-37269 Eschwege.
Apendicele 6
MEDII PENTRU CREȘTEREA ȘI IZOLAREA LUI C.M. SSP. SEPEDONICUS
Agar nutritiv (NA)
Agar nutritiv difco bacto în apă distilată la standardul producătorului. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Dextroză agar (NDA)
cu un conținut de 1% D(+) glucoză (monohidrat). Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 20 minute.
Drojdie-glucoză-peptonă agar (YPGA)
Extract de drojdie difco bacto (nr. 0127)
5 g
bacto Peptonă difco bacto (nr. 0118)
5 g
D(+) - glucoză (monohidrat)
10 g
Agar purificat difco bacto (nr. 0560)
15 g
Apă distilată
1 litru
Se sterilizează 0,5 l de mediu prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute.
Mediu de extract de drojdie de săruri minerale (YGM)
Extract de drojdie difco bacto
2,0 g
D(+) - glucoză (monohidrat)
2,5 g
K(2)HPO(4)
0,25 g
KH(2)PO(4)
0,25 g
MgSO(4) ● 7H(2)O
0,1 g
MnSO(4) ● H(2)O
0,015 g
NaCl
0,05 g
FeSO(4) ● 7H(2)O
0,005 g
Agar purificat difco bacto
18 g
Apă distilată
1 litru
Se sterilizează 0,5 l mediu prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute.
Apendicele 7
TESTE NUTRIȚIONALE ȘI FIZIOLOGICE PENTRU IDENTIFICAREA LUI C.M. SSP. SEPEDONICUS
Toate mediile trebuie să fie incubate la 21°C și se examinează după 6 zile. Dacă creșterea nu a avut loc, se incubează până la maximum 20 de zile.
- Testul oxidativ și fermentativ (Hugh și Leipson, 1953) - testul O/F.
Mediul de bază:
KCl
0,2 g
MgSO(4) ● 7H(2)O
0,2 g
NH(4)H(2)PO(4)
1,0 g
Peptonă difco bacto
1,0 g
Agar purificat difco bacto
3,0 g
D(+) - glucoză (monohidrat)
10,0 g
Albastru de bromtimol
0,03 g
Apă distilată
1 litru
Se amestecă și se ajustează la un pH de 7,0 până la 7,2 cu KOH 1N.
Se distribuie câte 5 ml și 10 ml în eprubeta de cultură Pyrex de 16 mm x 100 mm (capacitate 12 ml).
Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute
Se inoculează fiecare cultură prin înțepare adâncă în eprubeta de 5 și 10 ml. În mod antiseptic, se adaugă 1 până la 2 ml parafină lichidă sterilă în eprubeta de 10 ml. Se incubează.
Reacție pozitivă:
┌───────────────────┬───────────────────────────────┬──────────────────────────┐
│
Tub
│
Culoare
│
Interpretare
│
├───────────────────┼───────────────────────────────┼──────────────────────────┤
│Deschis
│Galben
│Fermentativă
│
│Închis
│Galben
│
│
│
│
│
│
│Deschis
│Galben
│Oxidativă
│
│Închis
│Verde-albastru
│
│
│
│
│
│
│Deschis
│Verzui
│Oxidativă sau inertă
│
│Închis
│Verde-albastru
│
│
└───────────────────┴───────────────────────────────┴──────────────────────────┘
- Testul oxidazei (Kovacs, 1956)
Reactivul lui Kovacs pentru testul oxidazei:
Soluție apoasă de dihidroclorură de tetrametil parafenilenediamin (BDH nr. 30386) 1% în apă distilată.
Acest reactiv trebuie să fie preparat proaspăt în volume de 1 ml sau poate fi conservat într-o sticlă maronie la 5°C timp de 1 până la patru săptămâni.
Se pune o picătură de reactiv pe o hârtie de filtru într-un vas Petri curat. Se rade imediat o parte din cultura de testare de pe agarul nutritiv utilizând o ansă de platină.
Reacție pozitivă: Apare o colorație purpurie în termen de 10 secunde. Culturile pentru care colorația apare într-un timp de 10 până la 30 de secunde sunt slab pozitive.
N.B.: Este esențial să se utilizeze o ansă de platină și culturi NA deoarece urmele de fier sau conținutul ridicat de zahăr din mediul de creștere pot da rezultate pozitive false.
- Producția de acid din lactoză, ramnoză, salicină, glicerol.
Se prepară un mediu Hugh și Leifson O/F rară glucoză. Se distribuie câte 5 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute. În procesul de topire, când baza atinge 45°C, se adaugă, în mod aseptic, 0,5 ml de soluție apoasă 1 0%, sterilizată prin filtrare, fie de glicerol, lactoză, ramnoză sau salicină. Se amestecă cu grijă.
Reacție pozitivă: Schimbarea culorii din verde-albastru în galben indică producerea acidului
- Testul catalazei
Se pune o picătură de peroxid de hidrogen (30 de volume) pe o lamă curată și se emulsifiază adăugând conținutul unei anse de platină de cultură.
Reacție pozitivă: Producerea de bule de oxigen indică prezența catalazei.
- Reductaza nitratului și denitrificarea (Bradbury, 1970)
Mediu de cultură:
KNO(3) (fără nitrit)
1 g
Extract de drojdie difco bacto
1 g
K(2)HPO(4)
5 g
Apă distilată
1 litru
Se dozează câte 10 ml în sticle de 20 ml. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Reactiv A:
H(2)SO(4)
8 g
Acid acetic 5N
1 litru
Reactiv B:
Naftilamină
5 g
Acid acetic 5N
1 litru
Se inoculează mediul de nitrat în duplicat. Se testează după 10 și 20 de zile adăugând o picătură de iod Lugol, 0,5 ml reactiv A și 0,5 ml reactiv B. Dacă mediul nu devine roșiatic, se adaugă aproximativ 50 mg pudră de zinc. Se observă reacția culorii.
Reacția pozitivă:
Reacția culorii
Etapa 1
Etapa 2
Nici o reducere de nitrat
incolor
roșu
Reducerea nitratului până la nitrit
roșu
(numai reductaza nitratului)
Reducerea nitratului peste nitrit
incolor
incolor
(denitrificare - reductaza nitratului
și nitritului)
- Producția de urează (Lelliott, 1966)
Mediu de cultură:
Bază de uree oxoid agar (CM53)
2,4 g
Apă distilată
95 ml
Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 20 de minute. Se răcește baza topită până la 50°C și se adaugă, în mod antiseptic, 5 ml de soluție de uree apoasă 40% (oxoid SR20) sterilizată prin filtrare. Se amestecă bine.
Se dozează câte 6 ml în eprubete sterile (16x100 mm) și se lasă să se depună în pantă.
Reacție pozitivă: Mediul galben-portocaliu capătă o colorație roșie vișinie sau roz fucsină, dacă s-a produs o urează.
Utilizarea citratului (Christensen) (Skerman, 1967)
Bază de titrat agar (Merck 2503)
23 g
Apă distilată
1 litru
Se amestecă și se dizolvă prin încălzire. Se dozează câte 6 ml, ca pentru mediul testului de producere a ureazei. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute și se lasă să se depună în pantă.
Reacție pozitivă: Utilizarea citratului este indicată printr-o reacție de schimbare a culorii mediului din portocaliu în roșu.
- Producția de sulfură de hidrogen (Ramamurthi, 1959)
Mediu:
Tripton difco bacto (nr. 0123)
10 g
K(2)HPO(4)
1 g
NaCl
5 g
Apă distilată
1 litru
Se dizolvă și se dozează câte 6 ml în eprubete de 16x100 mm. Se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 de minute.
Se inoculează. La gura eprubetei, în mod aseptic, se pune o hârtie de acetat de plumb (Merck 9511). Se fixează cu capacul. Se incubează timp de maximum douăzeci de zile.
Reacție pozitivă: Producerea H(2)S din tripton este indicată prin colorarea negru maronie a hârtiei reactive.
- Producere de indol (Ramamurthi 1959)
Mediu:
Ca și pentru testul H(2)S.
Se îndepărtează hârtia de acetat de plumb și se adaugă 1 până la 2 ml de eter dietilic și se agită ușor. Se lasă la decantat (5 min). Se adaugă 0,5 ml de reactiv Kovacs (Merck 9293) în eprubetă înclinat.
Reacție pozitivă: Prezența indolului este indicată prin apariția unei culori roșii în stratul galben dintre eter și faza apoasă.
- Creștere la 37°C (Ramamurthi, 1959)
Mediu:
Amestec nutritiv bacto difco
8 g
NaCl
70 g
Apă distilată
1 litru
Se amestecă, se dizolvă și se dozează câte 6 ml în eprubete.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute.
Se inoculează și se incubează la 37°C.
Reacție pozitivă: Se urmărește creșterea.
- Creșterea în clorură de sodiu 7% (Ramamurthi, 1959)
Mediu:
Amestec nutritiv difco bacto
8 g
NaCl
70 g
Apă distilată
1 litru
Se amestecă, se dizolvă și se dozează câte 6 ml în eprubete.
Sterilizați prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
Reacție pozitivă: Se urmărește creșterea.
- Hidroliza gelatinei (Lelliot, Billing & Hayward, 1966)
Mediu:
Gelatină difco bacto (nr. 0143)
120 g
Apă distilată
1 litru
Se amestecă, se dizolvă prin încălzire și se dozează câte 6 ml în eprubete.
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 de minute.
Reacție pozitivă: Lichefierea gelatinei chiar dacă temperatura rămâne de la 5°C timp de 30 de minute.
- Hidroliza amidonului
Mediu:
Agar nutritiv bacto difco (topit)
1 litru
Amidon solubil bacto difco (nr. 0178)
2 g
Se amestecă și se sterilizează prin autoclavare la 115°C timp de 10 minute.
Se toarnă în vase. Se inoculează vasele în spoturi.
Dacă se constată o creștere bună (10 până la 20 de zile), se prelevează o parte din produs și se imersează în iod Lugol.
Reacție pozitivă: Hidroliza amidonului este indicată prin zone limpezi, sub sau în jurul creșterii bacteriene; restul mediului se colorează în purpuriu.
- Hidrolaza esculinei (Sneath & Collins, 1974)
Mediu:
Peptonă bacto difco
10 g
Esculină
1 g
Citrat feric (Merck 3862)
0,05 g
Citrat de sodiu
1 g
Apă distilată
1 litru
Se dizolvă prin amestecare și se dozează câte 6 ml în eprubete. Se sterilizează în autoclavă la 115°C timp de 10 de minute.
Mediul este limpede, cu o fluorescentă albăstruie.
Reacție pozitivă: Hidroliza esculinei este indicată prin apariția unei culori maro și dispariția fluorescenței. Aceasta poate fi controlată utilizând o lampă cu raze ultraviolete.